陳花，徐德平

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫,214122)

葛花為豆科植物野葛(Puerarialobata(Willd.)Ohwi)或甘葛藤(PuerariathomsoniiBenth)的干燥花[1]。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其性甘、味涼[2]，具有解酒護(hù)肝、抗腫瘤、降壓、降血脂等功效，長期以來主要被用作治療酒毒引發(fā)的嘔吐、發(fā)熱煩渴、不思飲食、吐血等不適癥狀，素有“千杯不醉葛花湯”的美名[3-6]。劉建書[7]等證實(shí)飲料中添加葛花醇提物可以顯著預(yù)防小鼠酒精急性中毒。葛花中主要化學(xué)成分有黃酮類、揮發(fā)油、皂苷類等，且異黃酮類為解酒的主要功效組分之一[8-10]，劉瑩等[11]研究表明葛花醇粗提物與葛花總異黃酮有良好的解酒效果；姚美村等[12]研究制備了葛花水提物、乙醇提取物，發(fā)現(xiàn)其中的異黃酮提取物對于酒精性肝損傷具有很好的保護(hù)作用?？梢姼鸹ǖ慕饩乒πа芯窟€在處粗提物上，其解酒的功效成分及機(jī)理還未見相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。近年來，由于醉酒導(dǎo)致的社會和健康問題[13-14]引起了社會各界廣泛關(guān)注，解酒產(chǎn)品的需求越來越大，葛花因其價廉、高效、安全的優(yōu)勢在解酒產(chǎn)品的開發(fā)上有更廣闊的前景。

本文采用小鼠急性酒精中毒模型，對葛花解酒功效成分進(jìn)行系統(tǒng)篩選和分離研究，旨在明確葛花解酒的功效成分、以便對葛花進(jìn)行更加充分，高效地開發(fā)利用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑

葛花，安徽亳州中藥市場；雄性ICR小鼠(體質(zhì)量18～22 g)，上海斯萊克動物實(shí)驗(yàn)動物有限公司；GF254型硅膠板，南京金留化玻璃儀器公司； AB-8型大孔吸附樹脂，天津南開大學(xué)化學(xué)工廠；ODS填料，Nacalai Tosoh Inc；MCI GEL填料，Mitsubishi Chemical Corporation；ADH、ALDH試劑盒，南京建成生物工程有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

安捷倫7890B型氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；YF8-5型磨粉機(jī)，浙江省瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；RAT-100 型萃取罐，無錫申科儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海市力辰科技有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮科技有限公司； KB600型恒流泵，福建省新自立電機(jī)有限公司；ZF-90 型暗室紫外投射儀，上海顧順電光儀器廠；Avance 500 MHz型核磁共振儀，bruker公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 葛花提取物的制備與粗分離

稱取10 kg葛花粉碎后過40目篩，置于100 L萃取罐中，按1∶10(g∶mL)料液比加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，60 ℃條件下攪拌提取3 h，過濾取濾液，濾渣按上述方法重復(fù)提取2次，合并3次濾液進(jìn)行減壓濃縮得到醇提物。濾渣繼續(xù)按1∶10(g∶mL)料液比加入去離子水，60 ℃條件下重復(fù)攪拌提取1次，合并濾液減壓濃縮得葛花水提物(E)。

將葛花醇提物上AB-8型大孔樹脂(10 cm×150 cm)，用水、體積分?jǐn)?shù)為30%、60%、95%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜法(TLC)跟蹤檢測洗脫液中的成分，分別得到水洗脫物(A)、體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫物(B)、體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇洗脫物(C)、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇洗脫物(D)，將各組分與水提物分別減壓濃縮并冷凍保存。

2.2 水提物和醇物解酒活性

取4周齡ICR雄鼠(25.0 g)60只，隨機(jī)分成6組，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。于第6天經(jīng)口給藥，每天1次，共7 d，各實(shí)驗(yàn)組按1.0 g/(kg·d)劑量灌胃相應(yīng)的提取物，空白組小鼠灌胃等體積飲用水[15-16]。于給藥的第7天進(jìn)行小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[17-19]：實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，末次給藥(給水)后，30 min后空白組和各實(shí)驗(yàn)組灌胃45°白酒，灌酒劑量0.17 mL/10 g，記錄給藥、給酒時間。

(1) 翻正反射實(shí)驗(yàn)，觀察記錄各組小鼠翻正反射消失及恢復(fù)時間，計(jì)算醉酒潛伏期(自給酒至翻正反射消失時間)及醉睡時間(自翻正反射消失至恢復(fù)時間)，記錄醉酒動物數(shù)。翻正反射消失時間以小鼠背部向下保持30 s為標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)小鼠活動自如、精神、靈活，即為翻正反射恢復(fù)。

(2) 攀附實(shí)驗(yàn)，小鼠給酒后立即掛在垂直金屬網(wǎng)上，以小鼠掉落3次為終點(diǎn)，記錄小鼠在網(wǎng)上的攀附時間，反映小鼠酒后肌肉力量情況及醉酒狀態(tài)。

2.3 大孔樹脂洗脫活性組分的分離

將大孔樹脂洗脫物中有效解酒組分B上樣MCI柱(5 cm×100 cm)，用體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%乙醇洗脫，結(jié)合TLC法顯色反應(yīng)，分別得到B1、B2和B3、B4 4個部分。

2.4 MCI不同洗脫組分的解酒活性檢測

按2.2方法將MCI柱分離得到的B1、B2和B3、B4，進(jìn)行小鼠翻正反射實(shí)驗(yàn)和攀附實(shí)驗(yàn)，檢測各組分的解酒功效。

2.5 解酒活性組分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定

將2.4中有解酒活性的B2組分經(jīng)ODS-D(3 cm×100 cm)、ODS-AQ(3 cm×100 cm)色譜柱進(jìn)行分離，用體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇溶劑梯度洗脫，TLC薄層法跟蹤檢測洗脫液，將Rf值和顯色反應(yīng)一致的洗脫液合并，分離得3個單體化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，用氘代二甲亞砜溶解進(jìn)行1H NMR和13C NMR等光譜測定。

2.6 單體化合物的解酒功效研究

2.6.1 單體化合物解酒功效的行為學(xué)測定

將3個單體化合物按2.2的方法進(jìn)行翻正反射實(shí)驗(yàn)，觀察記錄醉酒潛伏期及醉睡時間，判定3個單體化合物的解酒功效。

2.6.2 小鼠血液乙醇濃度及ADH、ALDH活性的測定

(1)血液乙醇濃度的測定。小鼠按2.2中的方法給藥，末次給酒1 h后，眼眶取血，置肝素抗凝試管中，GC法進(jìn)行血醇濃度的檢測，色譜條件[20-21]為：N2流速2.0 mL/min；柱溫柱溫起始溫度75 ℃，以8 ℃ /min升到120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升到150℃，保持2 min。頂空條件80 ℃，加熱時間300 s。

(2)ADH、ALDH活性的測定。在眼眶采血后，解剖小鼠取出肝臟，用生理鹽水浸洗，從每只小鼠肝臟左葉邊緣切下一小塊組織，用濾紙吸干后電子天平稱重。按照ELISA方法測定乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)和乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)的活性。

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用(mean±SD)表示，采用單因素方差分析，0.01

3 結(jié)果與討論

3.1 葛花醇提物分離組分和水提物對小鼠醉酒時間的影響

水提物與大孔樹脂分離的不同洗脫組分對小鼠醉酒時間的影響如表1所示。

表1 葛花不同提取物對小鼠醉酒的影響Table 1 Effects of different extracts of Pueraria lobata on drunkenness in mice

注：*表示與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)。下同。

由表1可知與空白組相比，A組醉睡時間差異顯著，但小鼠耐受時間較差(P>0.05)，B組醉酒潛伏期為(52.62±6.93)min，醉睡時間為(221.13±41.25)min，攀附時間為(11.32±1.64)min，具有顯著性差異(P<0.05)；C、D、E醉酒潛伏期與空白組相比無顯著性差異；說明葛花醇提物中體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫物對于緩解小鼠急性酒精中毒的效果最好。

3.2 MCI不同分離部分的解酒作用

葛花醇提物經(jīng)大孔樹脂分離得到的體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫物具有顯著地緩解小鼠急性酒精中毒的效果，該部分經(jīng)MCI分離后得到B1、B2和B3、B4，4個部分薄層色譜圖如圖1所示，4個部分的解酒作用見表2，從表2可見，B2組醉酒潛伏期、攀附時間最長，醉睡時間顯著縮短，與空白組有顯著性差異(P<0.05)；B1、B3、B4三組與空白相比效果沒有明顯提升，說明葛花解酒的功效成分主要集中在MCI柱層析體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇洗脫物中。

圖1 B1、B2、B3、B4薄層色譜Fig.1 TLC of B1, B2, B3 and B4

表2 MCI不同分離部分對小鼠醒酒時間的影響Table 2 Effects of different extracts of pueraria on intoxication in mice

組別小鼠數(shù)/只醉酒數(shù)/只潛伏期/min醉睡時間/min攀附時間/min空白組101021.4±3.27456.20±55.48 5.03±0.79B1組101029.3±6.99358.60±99.418.43±0.37B2組101073.18±19.3?223.00±36.82?12.43±1.27?B3組10941.65±11.65395.60±68.60 8.26±0.81B4組10837.22±6.95345.4±112.365.23±0.90

3.3 單體化合物的鑒定

MCI柱層析分離得到具有解酒活性的B2組分，經(jīng)進(jìn)一步分離得到3個主要化合物的單體。化合物I為白色結(jié)晶，可溶于水，易溶于甲醇、乙醇。從1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)可見，δ8.49(1 H，s)、δ7.50(2 H，d，J=8.5)、δ7.43(1 H，s)、δ6.95(1 H，s)、δ5.10(1 H，s)，其中δ8.40處單峰H表明為異黃酮化合物，δ5.20為糖端基質(zhì)子，δ3.20～3.70為糖上的H。從13C-NMR可見，該化合物共有22個碳信號，糖上含有6個C，1個—OCH3，剩下15個碳信號，可以認(rèn)定化合物為黃酮化合物，結(jié)合135DEPT可知δ152.9為—CH信號，因此可得化合物為異黃酮類，通過以上分析并參照相關(guān)文獻(xiàn)[22-25]得出化合物為8-C-葡萄糖-鷹嘴豆素甲，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 化合物I、II、III的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structures of compounds I, II and III

化合物II為淺褐色結(jié)晶，可溶于水，易溶于乙醇、甲醇。從1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)可見，δ8.40(1 H，s)、δ7.43(2 H，d，J=8.5)、δ6.97(1 H，s)、δ6.87(2 H，d，J=8.5)、δ5.50(1 H，s)、δ5.20(1 H，s)，該化合物和化合物1相似，也為黃酮糖類成分，不同的是該化合物含有δ5.20和4.90兩個端基質(zhì)子，說明含有二糖基。從13C-NMR可見，該化合物共有26個碳信號，糖上含有11個C，從碳信號來看一個為葡萄糖，一個為木糖。通過以上分析并與相關(guān)文獻(xiàn)[22-25]對比得出化合物為8-C-葡萄糖-O-木糖-染料木素，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

化合物III為不定性淺黃色粉末，可溶于水，易溶于甲醇、乙醇。從1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)可見，δ8.40(1 H，s)、δ7.50(1 H，s)、δ7.43(2，d，J=8.5)、δ7.34(1 H，s)、δ6.87(2 H，d，J=8.5)、δ5.20(1 H，d，J=7.0)、δ3.91(3 H，s)，其中δ7.43和δ6.87中的4個H組成一個AA′BB′，表明該化合物有苯環(huán)對位取代，δ8.40處單峰H表明為異黃酮化合物二位上的H；δ7.50與δ7.34處2個H分別為黃酮A環(huán)上C6、C8位；δ5.20為糖端基質(zhì)子，從偶合常數(shù)為7的數(shù)值看應(yīng)為β連接；δ3.91處為甲氧基質(zhì)子信號，δ3.20～3.70為糖上的H。13C-NMR數(shù)據(jù)見表3，從表3可見，該化合物共有22個碳信號，其中糖上含有6個C，1個—OCH3，余下15個碳信號，是黃酮類化合物，結(jié)合135DEPT可知δ153.0為叔碳信號，可以推斷化合物為異黃酮。通過以上分析并參照相關(guān)文獻(xiàn)[22-25]判斷該化合物為印度黃酮苷，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

表3 化合物I、II、III 的13C核磁共振數(shù)據(jù)Table 3 13C NMR spectroscopic data of compoundI,II and III

注：“-”表示不存在此位。下同。

3.4 單體化合物的解酒功效

各單體化合物解酒作用見表4，從表中可以看出與空白組相比，化合物Ⅰ組的醉酒潛伏期和醉睡時間均有顯著差異(P<0.05)；化合物Ⅱ組的醉睡時間與空白組有顯著差異(P<0.05)，但耐受時間沒有顯著提高；化合物Ⅲ組的醉酒潛伏期與醉睡時間均無顯著差異(P>0.05)。表明化合物Ⅰ為葛花中解酒的主要功能成分，化合物Ⅱ也能較好地縮短醉酒時間，化合物Ⅰ、Ⅱ是否具有協(xié)同作用還需進(jìn)一步研究。

在小鼠血醇濃度方面，化合物Ⅰ組血醇濃度與模型組相比大幅下降且具有顯著差異，其余2組有所降低但無顯著效果。在ADH、ALDH活性方面，模型組2種酶活性略有升高，化合物Ⅰ組與空白組及模型組相比均具有顯著差異，其余2組酶活性提升方面無顯著效果。ADH、ALDH是體內(nèi)參與乙醇代謝的主要酶，能在氧化型輔酶存在下將乙醇氧化為乙醛，再由乙醛分解成乙酸，從以上結(jié)果可以得出化合物Ⅰ通過提高肝臟ADH、ALDH活性，加速酒精的分解，降低機(jī)體血醇濃度達(dá)到解酒作用。

本文篩選到3個化合物，其中化合物Ⅰ解酒效果最好，化合物Ⅱ有一定效果，化合物Ⅲ無作用，從三者的化學(xué)結(jié)構(gòu)來看都為異黃酮類，其中化合物Ⅰ與Ⅲ的C4′位都為—OCH3，但化合物Ⅰ、Ⅲ的糖鏈分別連在C8位和C7位，推測C8位的糖鏈影響了解酒作用的有無；化合物Ⅰ與Ⅱ C8位都存在糖鏈，但化合物Ⅱ C4′位為—OH，推測C4′位的基團(tuán)影響了解酒活性的大小。

表4 單體化合物的解酒功效Table 4 Antidrunk effect of monomer compounds

4 結(jié)論

葛花經(jīng)乙醇提取，大孔樹脂、MCI柱、ODS層析柱分離，結(jié)合解酒活性篩選，得到3種單體化合物，分別為8-C-葡萄糖-鷹嘴豆素甲、8-C-葡萄糖-O-木糖-染料木素、印度黃酮苷。其中化合物Ⅰ能顯著延長醉酒潛伏期、縮短醉酒時間,提高ADH和ALDH的活性,降低機(jī)體血醇濃度，具有極好的解酒效果；化合物Ⅱ有一定程度解酒作用；化合物Ⅲ在解酒方面則無作用。

本文首次分離并明確8-C-葡萄糖-鷹嘴豆素甲為葛花中解酒的功效成分，且由化合物的解酒效果及基團(tuán)連接的不同分析推測該化合物中C8位和C4′位基團(tuán)影響了解酒功效，而該位置的基團(tuán)是直接決定或是通過和主環(huán)的相互作用影解酒效果還需要進(jìn)一步科學(xué)驗(yàn)證。且該化合物提高ADH和ALDH水平的機(jī)理也需進(jìn)一步研究。