郝云彬，相興偉，周宇芳，夏文水*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江 舟山，316000)

2016年我國(guó)水產(chǎn)品的總產(chǎn)量為4 920萬(wàn)t，居世界首位[1]。但由于蝦體內(nèi)富含水分及蛋白質(zhì)，在加工貯藏過(guò)程中極易腐敗變質(zhì)，尤其是發(fā)生黑變[2]。黑變是由于蝦體內(nèi)富含的多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)使表面酪氨酸等色原物質(zhì)發(fā)生氧化，經(jīng)過(guò)一系列生化反應(yīng)生成了黑色素[3]。

水產(chǎn)品添加劑的使用直接關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量安全。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)普遍依賴亞硫酸鹽來(lái)抑制蝦類(lèi)黑變的發(fā)生[4]。但是，亞硫酸鹽的使用容易引發(fā)食品安全問(wèn)題[5-6]。歐盟、日本等都嚴(yán)格規(guī)定了蝦肉中SO2殘留不得超過(guò)0.1 mg/g[7]。另外，發(fā)達(dá)國(guó)家已率先研發(fā)出相對(duì)安全的4-己基間苯二酚(4-Hexylresorcinol，4-HR)來(lái)抑制蝦類(lèi)黑變的發(fā)生[8]。這可能會(huì)成為影響我國(guó)海水蝦類(lèi)出口的重大技術(shù)壁壘。因此，引進(jìn)國(guó)外海水蝦酚酶抑制劑，研發(fā)不同食品添加劑的協(xié)同防黑變新技術(shù)，對(duì)于解決產(chǎn)品質(zhì)量安全，提升我國(guó)水產(chǎn)品國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，增加漁民收入和漁業(yè)增效具有十分重要的意義。

本文針對(duì)包括前期研究的4種主要的酚酶抑制劑成分：4-HR、檸檬酸、抗壞血酸以及乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na)，分析影響多酚氧化酶活力的主因子及雙因子效應(yīng)，用降維法得出偏回歸解析子模型，對(duì)酶活抑制效果尋優(yōu)；研究了2種抑制因子對(duì)海水蝦酶促褐變的抑制效果以及抑制類(lèi)型，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模型探究復(fù)合抑制劑的抑制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4-己基間苯二酚(4-Hexylresorcinol，4-HR)、L-抗壞血酸(食品級(jí))、左旋多巴(Levodopa，L-DOPA)(分析純)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；丙酮、KH2PO4、K2HPO4、無(wú)水(NH4)2SO4等(分析純)、Tris-HCl緩沖液，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 海水蝦多酚氧化酶的制備

選擇東海區(qū)海捕蝦主要品種中華管鞭蝦為研究對(duì)象，其多酚氧化酶的制備采用XIANG[9]的方法。

1.3 方法

1.3.1 不同抑制因子組合的交互作用試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用丁希泉[10]的方法稍作修改。以4-HR、檸檬酸、抗壞血酸與EDTA-2Na作為抑制因子，目標(biāo)函數(shù)為多酚氧化酶活力，結(jié)合酚酶抑制特性研究的相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)如表1所示的因素水平表。每個(gè)水平的抑制因子先配制成一定濃度的50 mL處理液備用。

1.3.2 PPO酶活力測(cè)定方法

參照NIRMAL[11]的方法并略有改進(jìn)。以L-DOPA為特異性底物，將相應(yīng)濃度的處理液1 mL與0.5 mL的L-DOPA混合均勻，再加入0.5 mL PPO以及1 mL Tris-HCL緩沖液，45 ℃保溫10 min，再加入預(yù)冷的純水3 mL，混勻后在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度變化，測(cè)定6 min，每1 min吸光值增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位。

表1 效應(yīng)分析中參試抑制因子水平編碼表 單位：mmol/L

1.4 多酚氧化酶活力抑制因子的抑制機(jī)理

1.4.1 抑制因子對(duì)多酚氧化酶活力的抑制作用

將新提取的酶液與不同濃度的抑制因子混合，然后在冰箱中4 ℃靜置0.5 h，2種抑制因子在反應(yīng)體系中的終濃度如下：EDTA-2Na為0、0.6、1.0、1.4、1.8 g/L，檸檬酸為0、1、3、5、7 g/L，再加入0.01 mol/L的L-DOPA為底物。酶活測(cè)定方法同1.3.2，空白對(duì)照組以1 mL超純水代替抑制因子。酶被抑制因子處理前后酶活性變化以剩余酶活百分比表示。酶促反應(yīng)體系達(dá)到穩(wěn)定態(tài)后，吸光度隨時(shí)間延長(zhǎng)的線性段直線外推得到的橫截距為遲滯時(shí)間。

1.4.2 抑制因子對(duì)多酚氧化酶活性的抑制類(lèi)型

以L-DOPA為底物，在不同底物濃度下，測(cè)定不同濃度的EDTA-2Na與檸檬酸對(duì)PPO酶活的抑制效果。以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，判斷不同抑制劑的抑制類(lèi)型。其中L-DOPA底物的濃度均為0.001、0.003、0.005、0.008、0.010 mol/L，酶活測(cè)定方法同1.3.2。

1.5 抑制因子的分子結(jié)構(gòu)化學(xué)動(dòng)力學(xué)研究

采用ChemBioOffice Ultra軟件，利用分子動(dòng)力學(xué)模型MM2力場(chǎng)，基于量子化學(xué)的分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算方法對(duì)酶抑制反應(yīng)路徑進(jìn)行多次模擬優(yōu)化，利用密度泛函理論計(jì)算各反應(yīng)路徑中穩(wěn)態(tài)和過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)和能量，并對(duì)分子模擬結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證[12-15]。依此預(yù)測(cè)各抑制動(dòng)力學(xué)流程及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)變化特征，探討2種抑制因子的抑制機(jī)理。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，正交試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Excel 2007軟件繪圖。采用ChemBioOffice Ultra軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算，并繪制反應(yīng)流程圖及結(jié)構(gòu)變化示意圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抑制因子組合對(duì)甲殼類(lèi)多酚氧化酶活力的影響

按表1中參試抑制因子水平進(jìn)行多酚氧化酶酶活抑制試驗(yàn)，試驗(yàn)和分析結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 各參試因子試驗(yàn)結(jié)構(gòu)矩陣及測(cè)試結(jié)果Table 2 Structure matrix and results of each test

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis

2.2 影響多酚氧化酶活力的主因子效應(yīng)分析

表4 主因子效應(yīng)值Table 4 Principal factor effect value

2.3 響應(yīng)面曲面分析

通過(guò)響應(yīng)曲面分析得到X1X4、X3X4、X2X3的偏回歸解析子模型為：

圖1是模型的響應(yīng)曲面，從中可以直觀地看出，當(dāng)檸檬酸和抗壞血酸的用量處于低編碼值水平時(shí)，隨著4-HR用量的增加，酶活力下降；當(dāng)檸檬酸和抗壞血酸處于較高編碼水平時(shí)，4-HR濃度的提高卻最終導(dǎo)致酶活力有增加趨勢(shì)，說(shuō)明高濃度的檸檬酸將顯著削弱4-HR的作用效果。當(dāng)EDTA-2Na處于較低編碼值水平時(shí)，隨著抗壞血酸用量的增加，酶活力下降；但當(dāng)EDTA-2Na處于較高編碼水平時(shí)，抗壞血酸導(dǎo)致酶活性的下降趨勢(shì)緩慢，說(shuō)明高濃度的EDTA-2Na對(duì)抗壞血酸的抑制效果有削弱作用。

2.4 酶活抑制效果的模擬尋優(yōu)

采用數(shù)學(xué)模擬對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行分析的結(jié)果表明，當(dāng)4-HR、抗壞血酸、檸檬酸、EDTA-2Na的質(zhì)量濃度分別為0.46～0.68、0.01～0.018、4.85～7.20、1.58～2.90 mg/mL時(shí)，多酚氧化酶的酶活可抑制在14以下，抑制率達(dá)60%以上。

2.5 多酚氧化酶的抑制機(jī)理

2.5.1 抑制劑對(duì)多酚氧化酶酶促反應(yīng)的影響

從圖2可以看出，隨著檸檬酸和EDTA-2Na質(zhì)量濃度的增加，多酚氧化酶的催化活性均逐漸降低。在反應(yīng)中沒(méi)有抑制劑時(shí)，反應(yīng)的遲滯時(shí)間分別為126.34、135.23 s；當(dāng)體系中檸檬酸和EDTA-2Na質(zhì)量濃度分別達(dá)到1.8 g/L時(shí)，酶的活力均降至45.8%，遲滯時(shí)間分別達(dá)到1094.65 s和1186.65 s。呂敏等也發(fā)現(xiàn)，在多種抑制劑中，檸檬酸和EDTA對(duì)中華管鞭蝦PPO活性抑制作用較強(qiáng)[16]。

a-檸檬酸(X1)與4-HR(X4)的雙因子效應(yīng)分析；b-抗壞血酸(X3)與4-HR(X4)的雙因子效應(yīng)分析； c-EDTA-2Na(X2)與抗壞血酸(X3)的雙因子效應(yīng)分析圖1 各因素交互作用等高線和響應(yīng)面Fig.1 Response surfaces of the pairwise interactive effects of four extraction

圖2 抑制因子對(duì)多酚氧化酶的酶活力和遲滯時(shí)間的影響Fig.2 Effects of inhibiting factor on the enzyme activity and hysteresis time of phenol oxidase

2.5.2 抑制劑對(duì)多酚氧化酶的抑制類(lèi)型

從圖3可以看出，檸檬酸與EDTA-2Na抑制PPO催化底物的反應(yīng)中，反應(yīng)的最大速率不變，但是米氏常數(shù)隨抑制劑濃度的增大而增大，說(shuō)明2種因子同底物競(jìng)爭(zhēng)性地與酶結(jié)合。

a-檸檬酸對(duì)多酚氧化酶的抑制類(lèi)型Lineweaver-Burk作圖;b-EDTA-2Na對(duì)多酚氧化酶的抑制類(lèi)型Lineweaver-Burk作圖圖3 檸檬酸以及EDTA-2Na對(duì)多酚氧化酶的抑制類(lèi)型Fig.3 Effect of citric acid on phenol oxidase

2.6 兩種抑制因子抑制機(jī)理探討

多酚氧化酶是多亞基的含銅金屬酶，每個(gè)亞基含2個(gè)金屬銅離子，它們分別與蛋白質(zhì)分子中2個(gè)平展的組氨酸和1個(gè)弱的直立組氨酸配體結(jié)合，另有1個(gè)內(nèi)源橋基將2個(gè)銅離子聯(lián)系在一起，構(gòu)成多酚氧化酶催化氧化反應(yīng)活性中心[17]。根據(jù)分子軌道理論，檸檬酸和EDTA-2Na與多酚氧化酶結(jié)合的穩(wěn)態(tài)最小能量為458、450 kcal/mol，而這一能量數(shù)值與底物鄰苯二酚(463 kcal/mol)相近，表明檸檬酸和EDTA-2Na與鄰苯二酚可能構(gòu)成直接競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

檸檬酸羧基活性高，可與多酚氧化酶結(jié)合。同時(shí)，該類(lèi)絡(luò)合物既能發(fā)生分子內(nèi)絡(luò)合，也可與另一個(gè)檸檬酸分子實(shí)現(xiàn)分子間絡(luò)合。這兩類(lèi)反應(yīng)都具有很低的絡(luò)合能量(122～139 kcal/mol)，生成的化合物較為穩(wěn)定。因此，檸檬酸與多酚氧化酶活性體生成的高穩(wěn)定性單體會(huì)降低多酚氧化酶與底物的接觸濃度，從而發(fā)揮抑制作用。由于檸檬酸抑制體系是分子力學(xué)上動(dòng)態(tài)的可逆反應(yīng)，體系的反應(yīng)程度有限，所以檸檬酸只能發(fā)揮有限的抑制作用，并不能徹底防止黑變的發(fā)生。當(dāng)EDTA-2Na分子上一個(gè)羧基與多酚氧化酶絡(luò)合后，該分子上的另一個(gè)羧基更傾向于與多酚氧化酶絡(luò)合，因?yàn)檫@種絡(luò)合態(tài)能量更低(分子內(nèi)絡(luò)合能量值為167 kcal/mol，而分子間絡(luò)合能量值為197 kcal/mol)。由于EDTA-2Na易解離和接受氫離子，氫離子濃度對(duì)EDTA-2Na的絡(luò)合影響很大，通過(guò)調(diào)節(jié)氫離子的濃度可以實(shí)現(xiàn)EDTA-2Na的可逆絡(luò)合反應(yīng)。EDTA-2Na與檸檬酸的作用機(jī)理類(lèi)似，體系的反應(yīng)程度有限，僅能夠有限地抑制黑變的發(fā)生。

圖4 檸檬酸與EDTA-2Na抑制多酚氧化酶化學(xué)原理圖Fig.4 Chemical schematic diagram of citric acid and EDTA-2Na inhibiting phenol oxidase

2.7 復(fù)合抑制劑對(duì)多酚氧化酶抑制機(jī)理分析

2.7.1 4-HR與抗壞血酸的抑制機(jī)理[18-20]

4-HR、抗壞血酸均能抑制海水蝦多酚氧化酶活性。它們與PPO雙銅活性中心的初始結(jié)合能量較低，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合活性中心發(fā)揮抑制效果。在反應(yīng)過(guò)程中，4-HR與PPO會(huì)生成一種高穩(wěn)定絡(luò)合物，持續(xù)有效地消耗PPO，降低酶與底物的接觸濃度，在較大程度上抑制黑變。抗壞血酸則存在2種作用機(jī)制，一方面能通過(guò)與多酚氧化酶活性中心絡(luò)合，直接對(duì)PPO酶產(chǎn)生抑制作用；另一方面能通過(guò)還原中間產(chǎn)物醛類(lèi)，抑制黑色素的生成。

2.7.2 抑制因子交互作用機(jī)理分析

復(fù)合抑制劑主要作用組分之間存在交互效應(yīng)，其中低濃度的檸檬酸、抗壞血酸與4-HR存在一定的正交作用；而高濃度的檸檬酸、抗壞血酸會(huì)削弱4-HR的抑制效果。檸檬酸與抗壞血酸酸性較強(qiáng)，容易解離出氫離子，可作為較強(qiáng)的親核試劑進(jìn)攻多酚氧化酶活性中心。同時(shí)，它們的結(jié)構(gòu)變型性好、空間位阻小，更容易與多酚氧化酶結(jié)合，這一點(diǎn)可以從分子力場(chǎng)軌道模型的最小穩(wěn)態(tài)能量得到體現(xiàn)(檸檬酸、抗壞血酸、4-HR與酶結(jié)合的最小能量分別是458、461和463 kcal/mol)。同時(shí)，檸檬酸和抗壞血酸的結(jié)合是可逆的，所以在高濃度條件下，它們會(huì)降低4-HR與多酚氧化酶的接觸濃度從而削弱4-HR的抑制效果。至于高濃度EDTA-2Na對(duì)抗壞血酸的抑制作用也有削弱效果，可能由于高濃度的EDTA-2Na與抗壞血酸較強(qiáng)的氫鍵絡(luò)合作用降低了抗壞血酸與多酚氧化酶的接觸濃度。

2.7.3 復(fù)合抑制劑抑制機(jī)理探討

4種抑制因子與多酚氧化酶雙銅活性中心的初始結(jié)合能量大小接近，均易與多酚氧化酶活性中心結(jié)合，起到抑制效果。其中4-HR幾乎不可逆地與多酚氧化酶結(jié)合，持續(xù)有效地消耗多酚氧化酶，較大程度上抑制黑變。而抗壞血酸、檸檬酸和EDTA-2Na與多酚氧化酶則形成動(dòng)力學(xué)上的可逆平衡，因此只能在一定程度上抑制黑變。

在復(fù)配體系中，4-HR的溶解是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，其他組分的存在，有利于提高4-HR的離子化水平，保障其有效作用濃度。同時(shí)抗壞血酸、檸檬酸與EDTA-2Na均呈酸性，可解離出一定濃度的氫離子，適量氫離子的存在，能增強(qiáng)4-HR與其他組分的氫鍵配位絡(luò)合效應(yīng)，進(jìn)而提高4-HR的水溶性。

綜上所述，復(fù)合抑制劑中4-HR通過(guò)與多酚氧化酶形成高穩(wěn)定的絡(luò)合物來(lái)主導(dǎo)抑制效果，適量檸檬酸、抗壞血酸、EDTA-2Na的存在，既可通過(guò)銅絡(luò)合發(fā)揮抑制作用，也可提高4-HR的氫鍵配位絡(luò)合能，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)合抑制劑的高抑制效果。

3 結(jié)論

(1)4種抑制劑的抑制能力從大到小依次為4-HR、抗壞血酸、檸檬酸和EDTA-2Na。高濃度的檸檬酸、抗壞血酸將顯著削弱4-HR的作用效果，高濃度EDTA-2Na也會(huì)削弱抗壞血酸的抑制效果。當(dāng)4-HR、抗壞血酸、檸檬酸、EDTA-2Na的質(zhì)量濃度分別為0.01～0.018、0.46～0.68、4.85～7.20、1.58～2.90 mg/mL時(shí)，復(fù)合抑制劑的抑制率達(dá)60%以上。

(2)4種因子均同底物競(jìng)爭(zhēng)性地與酶結(jié)合。復(fù)合抑制劑中4-HR通過(guò)與多酚氧化酶形成高穩(wěn)定的絡(luò)合物來(lái)主導(dǎo)抑制效果，適量檸檬酸、抗壞血酸、EDTA-2Na的存在，既可通過(guò)銅絡(luò)合發(fā)揮抑制作用，也可提高4-HR的氫鍵配位絡(luò)合能，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)合抑制劑的高抑制效果。但在高濃度條件下，檸檬酸和抗壞血酸會(huì)降低4-HR與多酚氧化酶的接觸程度，從而對(duì)4-HR抑制作用起到了削弱效果。