沈建偉，李天才，周黨衛(wèi)，王環(huán)

（1.青海省藏藥藥理學和安全性評價研究重點實驗室，青海西寧 810008；2.中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧 810008）

黃芪甲苷是從豆科植物黃芪（Astragalus membranaceus Bunge）根中提取到的一種活性化合物，有“超級黃芪多糖”之稱，具有增強機體免疫力、提高機體抗病能力等功效。黃芪甲苷在紫外區(qū)僅有弱的末端吸收，也無熒光發(fā)射特性，采用低波長紫外檢測時干擾較大[1]。黃芪甲苷是黃芪藥材中的主要功效成分，《中華人民共和國藥典》2015年版一部黃芪含量測定項下，采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測黃芪藥材中黃芪甲苷含量[2]。電霧式檢測器（Charged Aerosol Detection， CAD）是近些年發(fā)展起來的更加精密的通用型液相色譜檢測器，更加適合紫外吸收弱的化合物含量檢測。CAD的基本工作原理為：液相洗脫液首先在氮氣的作用下霧化形成液滴，其中較大的液滴在碰撞器作用下經廢液管流出，較小的溶質液滴在干燥管中干燥，溶劑和揮發(fā)性物質被蒸發(fā)，形成溶質氣溶膠微小顆粒。同時，分流形成的第二股氮氣經過含高壓鉑金絲電極的電暈式裝置形成帶正電荷的氮氣流，與溶質氣溶膠顆粒迎面相遇，經碰撞使溶脂顆粒帶上正電荷。含溶質顆粒的氣流隨后通過帶有低負電壓直流電的離子阱裝置，在電場作用下，遷移率較大，顆粒粒度較小的氮氣吸附在直流電陰極，電荷被中和，隨后遷移率小的帶電顆粒把它們的電荷轉移給顆粒收集器，最后用一個高靈敏度的靜電檢測計測出帶電溶質的信號電流。由此產生的信號電流與溶質含量呈比例關系[3]。與蒸發(fā)光散射檢測器相比，電霧式檢測器具有更高的檢測靈敏度及穩(wěn)定性。為進一步減小溶劑干擾及基線漂移，本研究擬通過分離色譜柱之后增加溶劑補償、柱溫控制及霧化溫度控制，優(yōu)化出食品及中藥中黃芪甲苷檢測的更理想檢測方法，以期對黃芪甲苷的質量控制提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈，山東禹王實業(yè)有限公司生產，色譜純；甲醇，山東禹王實業(yè)有限公司生產，色譜純；去離子水，美國Millipore公司凈水機提供；高純氮氣，純度99.999%，蘭州裕隆氣體股份有限公司生產；黃芪甲苷標準物質，中檢所，批號110781，純度≥98%。

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀（3000RS三元梯度泵，TCC-3000SD柱溫箱，Corona Ultra電霧式檢測器）及Dionex ISO-3100SD等度泵。

1.2 儲備溶液及工作溶液配制

稱取干燥后的黃芪甲苷標準品5.42 mg，加入甲醇溶解并精確定容至10.0 mL，即得0.542 mg/mL黃芪甲苷儲備液；用移液管精確吸取2.0 mL黃芪甲苷儲備液，再精確吸取2.0 mL甲醇，充分混勻，即得0.271 mg/mL黃芪甲苷工作溶液。

1.3 儀器分析條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流動相3000RS三元梯度泵（泵1）的流動相A（水）∶流動相B（乙腈）（V/V）=65∶35，流速1.0 mL/min。泵2（ISO-3100SD）的流動相為色譜乙腈，通過三通導入并與色譜柱分離得到的洗脫液混合均勻后進入電霧式檢測器，從而實現(xiàn)溶劑補償。

電霧式檢測器參數(shù)設置：采集頻率10 Hz；霧化器壓力35.0 psi。

1.4 試驗方法

在進樣相同體積工作液時，通過控制試驗不同的溶劑補償體積、不同的柱溫箱溫度、不同的霧化溫度。泵2（ISO-3100SD）補償流速設置的0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 5個梯度；柱溫箱溫度分別設置為室溫、30 ℃兩個處理；霧化溫度分別設置25 ℃及30 ℃兩個處理，記錄檢測器記錄的檢測物電信號積分及高度。

2 結果與分析

2.1 補償溶劑流速對信號相應的影響

在色譜柱柱溫為室溫、霧化溫度25 ℃條件下，液相色譜每次進樣黃芪甲苷標準工作液（0.271 mg/mL）20 μL。補償溶劑流速對信號的影響如圖1所示。由圖1可以看出，隨著溶劑補償?shù)脑黾樱S芪甲苷色譜保留時間在逐漸增加，積分面積也在相應增加。

由上到下依次為：未補償、0.2 mL/min、0.4 mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min乙腈黃芪甲苷的色譜積分、峰高及信噪比如表1所示。

表1 不同補償體積對響應信號的影響

由表1可以看出，在補償流速小于0.8 mL/min時，積分面積隨著有機溶劑補償流速的增加而增大，積分面積及峰高在0.8 mL/min時達到最高，為23.972 1 pA·min及70.35 pA；補償溶劑流速為1.0 mL/min時，積分面積減小，這可能與溶劑補償引起的稀釋效應有關；在0.2 mL/min及0.4 mL/min補償條件下，黃芪甲苷積分面積增加較快，而0.6 mL/min及0.8 mL/min補償條件下，積分面積增加值逐漸減小。同時可以看出，信噪比在補償流速為0.6 mL時達到最大，為111.6。因此，從節(jié)約試劑及減小成本角度出發(fā)，認為有機溶劑補償流速為0.4 mL/min即可實現(xiàn)色譜峰面積變大，色譜峰變高，檢測器靈敏度提高的目的。

圖1 溶劑補償對黃芪甲苷色譜峰的影響

2.2 柱溫箱溫度對信號強度的影響

在0.4 mL/min有機溶劑補償及30 ℃霧化條件下，研究柱溫箱在30 ℃及35 ℃對色譜信號的影響，具體數(shù)值如表2所示。

由表2可以看出，柱溫箱溫度的升高對積分面積及峰高影響不明顯；但隨著柱溫升高，信噪比增加，基線信號更加穩(wěn)定，靈敏度升高。

2.3 霧化溫度對信號響應的影響

在0.4 mL/min有機溶劑補償及30 ℃柱溫箱加熱條件下，研究霧化溫度在25 ℃、30 ℃及35 ℃條件下對色譜響應的影響，具體數(shù)值如表3所示。

表2 柱溫箱溫度對信號相應的影響

表3 霧化溫度對信號相應的影響

由表3可以看出，在柱溫為30 ℃條件下，霧化溫度的升高對積分面積及峰高的影響并不明顯，但同時霧化溫度升高使得信噪比減小，其中的原因有待進一步研究。

3 結論

本實驗對柱后補償電霧式液相色譜儀測定黃芪甲苷含量從溶劑補償流速、柱溫箱溫度、霧化溫度三維度，在相同進樣量、相同流動相組成及流速的條件下進行了系統(tǒng)研究。通過積分面積、峰高、信噪比三個指標綜合評判，最終確定黃芪甲苷溶劑補償電霧式液相色譜儀的最佳色譜條件為：0.4 mL/min乙腈補償，柱溫箱溫度30 ℃，霧化溫度30 ℃。本研究的實驗結果可用于采用電霧式檢測器測定黃芪甲苷含量的測定。