李飛，潘妍，張建平＊

（1.臺州學(xué)院，浙江臺州 318000；2.臺州市耶大基因與細(xì)胞治療研究院，浙江臺州 318000）

人們不斷深入研究腫瘤的治療措施，免疫細(xì)胞療法被逐漸廣泛應(yīng)用。外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）通過富集外周血干細(xì)胞來治療免疫缺陷疾病、代謝性遺傳疾病、惡性血液病等疾病[1]。PBMC包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞等，對于評價免疫反應(yīng)起到非常重要的作用[2]。目前，相關(guān)PBMC分離優(yōu)化的文獻(xiàn)相對不多，本文通過研究PBMC分離優(yōu)化條件，提高細(xì)胞的分離率與收集率，在一定程度上減少分離時間和原料，提高細(xì)胞獲得率與純度，為臨床與基礎(chǔ)細(xì)胞學(xué)研究提供一個較為有效的細(xì)胞獲取途徑以便后續(xù)免疫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。本文提取PBMC通過ficoll密度梯度離心法，從離心和洗滌兩個方面探究人外周血干細(xì)胞最佳分離條件。

1 材料

1.1 材料來源

血液來自成年獻(xiàn)血者，其年齡為20～30歲，身高160～180 cm，體重50～80 kg，獻(xiàn)血者在采集期間身體健康，無感冒等生病跡象。

1.2 主要設(shè)備與試劑

生物安全柜（1374，Thermo）、高速冷凍離心機(jī)（ST16R，Thermo）、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Vi-CELL XR，Beckman Coulter）。

人全血單個核細(xì)胞分離液（LDS1076，TBD）磷酸鹽緩沖液（PBS）（311-010-CL，WISENT INC）、hanks液（HBSS）（AC13716284，HyCIoneTM）。

2 方法

2.1 采集與運(yùn)輸

將止血帶綁于手臂上臂，用碘伏對皮膚進(jìn)行消毒，將采血針穿刺進(jìn)靜脈，另一端連接采血管。妥善固定針頭。采血結(jié)束后，靜脈穿刺局部以無菌棉球按壓5min，同時移除針頭，另一端也移出采血管。平緩搖動采血管，使血液與抗凝劑混勻。

在采血管外貼上標(biāo)簽，注明姓名等信息。核對信息正確后將外周血瓶及采集的臍血血樣放入專門運(yùn)輸箱，嚴(yán)禁X線照射（安檢），盡快送達(dá)干細(xì)胞庫，時間不超過24h。

2.2 PBMC分離

2.2.1 分離離心

統(tǒng)一在溫度20 ℃、濕度50%RH的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)，使用15 mL離心管，取一支離心管將1 mL外周血與等體積稀釋劑（洗滌劑）混勻，加到另一支裝有梯度體積的Ficoll（分離液）的離心管中，緩慢地加到Ficoll液面上。進(jìn)行梯度離心。

2.2.2 洗滌離心

分離離心后，吸取離心管內(nèi)白膜層轉(zhuǎn)移至另一支離心管內(nèi)，加洗滌劑至12mL，振蕩混勻，離心（1 500 r/min，10 min，升9降9）。棄上清，保留2mL洗滌劑重懸細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.3 不同離心力轉(zhuǎn)速、時間、升降因素

采用三因素三水平列正交表（表1），進(jìn)行離心因素實(shí)驗(yàn)。按梯度進(jìn)行分離離心后采用進(jìn)行洗滌離心吸取離心管內(nèi)白膜層轉(zhuǎn)移至另一支離心管內(nèi)，加洗滌劑（0.9%的生理鹽水）至12mL，振蕩混勻，離心（1500r/min，10min，升9降9）。棄上清，保留2mL洗滌劑重懸細(xì)胞利用細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

表1 離心力轉(zhuǎn)速、時間、升降速度三因素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.4 不同分離液體積、洗滌液體積、洗滌次數(shù)因素

采用三因素三水平列正交表（表2），進(jìn)行洗滌因素實(shí)驗(yàn)。分離離心（600g、30min、升9降0）后，洗滌劑為0.9%的生理鹽水，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表2 分離液體積、洗滌液體積、洗滌次數(shù)三因素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.5 不同緩沖液（洗滌劑）因素

分別使用PBS、HBSS、0.9%的生理鹽水進(jìn)行分離離心（600g、20min、升9降0），洗滌離心（1 500 r/min，10min，升9降9）。棄上清，保留2mL洗滌劑重懸細(xì)胞利用細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.6 數(shù)據(jù)處理

正交表實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)助手II v3.1分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用+s表示，組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05差異具有顯著意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 離心因素分離PBMC的活細(xì)胞數(shù)量

首先通過方差分析進(jìn)行F檢驗(yàn)，差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然后進(jìn)行直觀分析，如表3，極差排序?yàn)殡x心轉(zhuǎn)速＞離心時間＞離心升降，離心轉(zhuǎn)速極差最大，為主要影響因素。實(shí)驗(yàn)指標(biāo)越大越好，查看均值水平對應(yīng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，確定該正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合離心轉(zhuǎn)速應(yīng)為600g。

表3 離心因素實(shí)驗(yàn)分離PBMC的活細(xì)胞數(shù)量（×106/mL）

3.2 洗滌因素分離PBMC的活細(xì)胞數(shù)量

首先通過方差分析進(jìn)行F檢驗(yàn)，F(xiàn)icoll體積在給定顯著性水平α=0.10中，F(xiàn)比=3.462＞F臨=3.110差異一般顯著。然后進(jìn)行直觀分析，如表4，極差排序?yàn)镕icoll體積＞洗滌次數(shù)＞洗滌液體積，F(xiàn)icoll體積極差最大，為主要影響因素。實(shí)驗(yàn)指標(biāo)越大越好，查看均值水平對應(yīng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，確定該正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合Ficoll體積應(yīng)為2mL。

表4 洗滌因素實(shí)驗(yàn)分離PBMC的活細(xì)胞數(shù)量（×106/mL）

3.3 緩沖液因素分離PBMC的活細(xì)胞數(shù)量和活率

通過密度梯度離心法原理，三者緩沖液中0.9%的生理鹽水溶液的密度最小，假設(shè)其獲得細(xì)胞數(shù)量最多。通過數(shù)據(jù)分析如表5可知，使用PBS、HBSS緩沖液時，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。使用0.9%的生理鹽水緩沖液分離PBMC的活細(xì)胞數(shù)量最多和活率最大。

表5 緩沖液因素分離PBMC的活細(xì)胞數(shù)量和活率

4 結(jié)論

外周血單個核細(xì)胞在艾滋病、肝炎等傳染病樣本資源庫作為儲存的重要樣本。其采集具有安全性高、痛苦性小、無需麻醉、自身血小板和粒細(xì)胞恢復(fù)快等特點(diǎn)，有助于更好的治療患者[3]。通過研究PBMC分離優(yōu)化條件，提高細(xì)胞的分離率與收集率，針對工藝化方面提高采集效率及產(chǎn)品純度有重要意義。

該實(shí)驗(yàn)通過從分離離心方面考慮離心機(jī)轉(zhuǎn)速、時間、升降三因素，比較活細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)離心機(jī)轉(zhuǎn)速因素影響較大，600g，30min，升9降0可為分離1mL原血PBMC的初步最適條件；從洗滌收集方面考慮分離液體積，洗滌液體積，洗滌次數(shù)三因素，比較活細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)2倍分離液體積，8倍洗滌體積，1次洗滌為初步最適條件；從洗滌離心收集方面考慮緩沖液的影響，發(fā)現(xiàn)0.9%的生理鹽水其活細(xì)胞濃度最高?；谏鲜鼋Y(jié)論，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)儀器、試劑等條件，調(diào)整優(yōu)化來滿足實(shí)驗(yàn)需求，分離出更有活力、更多的PBMC。