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        經(jīng)典名方三痹湯中龍膽苦苷含量測定方法研究

        2019-11-07 11:04:02但宇超曾琪馬安獻(xiàn)張惠芹季宗念嚴(yán)啟新
        生物化工 2019年5期

        但宇超,曾琪,馬安獻(xiàn),張惠芹,季宗念,嚴(yán)啟新

        (海王百草堂藥業(yè)有限公司,河南濮陽 457000)

        三痹湯(San Bi Tang),來源于《婦人大全良方》卷三[1]。組方為黃芪、續(xù)斷、人參、茯苓、甘草、當(dāng)歸、川芎、白芍、生地黃、杜仲、川牛膝、桂心、細(xì)辛、秦艽、川獨(dú)活、防風(fēng)、生姜以及大棗。三痹湯是一種袪風(fēng)之劑,其功能是益氣活血、補(bǔ)腎散寒、祛風(fēng)除濕,用于筋脈拘攣、骨節(jié)酸痛、日晡潮熱[2]、小兒疳積發(fā)熱,主要有效成分為龍膽苦苷[3]。本實(shí)驗(yàn)建立了龍膽苦苷的測定方法,為三痹湯的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 儀器

        1260infinityⅡ安捷倫高效液相色譜儀(openlabcds色譜工作站);Inetsil-ODS C18色譜柱[4](4.6 mm×250mm,5.0 μm;填料:十八烷基硅烷鍵合硅膠;安捷倫公司);METLERTOLED分析天平(十萬分之一);超聲清洗儀。

        1.2 試劑

        對照品龍膽苦苷,購于中國食品藥品檢定研究院(批號20180114),純度大于98%;甲醇、乙腈為色譜純,水為怡寶純凈水。[5]

        2 檢測方法的建立

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備[6]

        精密稱取各對照品適量,加50%甲醇制成混合對照品溶液,質(zhì)量濃度為20.00μg/mL。

        2.2 供試品溶液的制備

        取提取物粉末約1.000g,精密稱定,加入50%乙醇溶液50.00mL,超聲(功率250W,頻率40kHz)提取30min,冷卻,再次稱量,用50%乙醇溶液補(bǔ)足減失的量,搖勻,過濾,取濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾,即得。

        2.3 色譜條件

        采用Inetsil-ODS C18(4.6mm×250mm,5 μm)色譜柱,柱溫25℃,流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液[7],梯度洗脫(見表1),流速1mL/min,檢測波長250nm,進(jìn)樣量10μL,洗脫時間60min。

        表1 梯度洗脫設(shè)置

        2.4 精密度考察

        精密吸取同一份三痹湯供試品溶液10μL連續(xù)進(jìn)樣6次,以龍膽苦苷為參照峰,計算保留時間RSD和相對峰面積RSD均小于2%,相似度均大于0.99,表明該方法重復(fù)性良好,見表2、表3。

        表2 龍膽苦苷日內(nèi)精密度

        表3 龍膽苦苷日間精密度

        2.5 重現(xiàn)性考察

        取同一個批次三痹湯樣品6份,按照2供試品溶液制備方法制備三痹湯供試品溶液,每份3個平行,按照2.3中色譜條件分別進(jìn)樣,記錄峰面積,其RSD范圍在1.23%~2.14%,表明方法重復(fù)性良好。見表4。

        2.6 穩(wěn)定性考察

        精密吸取同一份供試品溶液,按2.3中色譜條件,分別在0、1、2、4、8、12、24、48 h和72h進(jìn)樣10 μL,記錄色譜圖,以龍膽苦苷為參照峰,計算得保留時間RSD和相對峰面積RSD均小于2%,相似度均大于0.99,表明供試品溶液72h內(nèi)穩(wěn)定,見表5。

        表4 重現(xiàn)性考察

        表5 穩(wěn)定性考察

        2.7 三痹湯中主要成分龍膽苦苷的含量測定

        2.7.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

        混合對照品和提取物供試品溶液按照2.3中色譜條件分析,分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)大于5000。混合對照品和供試品溶液色譜圖如圖1、圖2所示。

        2.7.2 線性范圍考察

        將以上制造的混合對照品,稀釋成系列不同梯度濃度的對照品溶液,按照3中色譜條件依次注入液相色譜儀測定峰面積,以峰面積和濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表6。

        圖2 供試品溶液色譜圖

        表6 龍膽苦苷濃度與峰面積線性表

        線性回歸方程為:y=27.739x+0.2649,R=0.999,符合要求。

        2.7.3 回收率試驗(yàn)

        取重復(fù)性試驗(yàn)同批樣品,分別按照近似0.8∶1、1∶1、1.2∶1添加龍膽苦苷對照品,加入樣品中,按照2.2進(jìn)行樣品制備,按照2.3中色譜條件進(jìn)行分析測定,計算平均回收率為98.4%~101.5%,RSD在1.23%~2.02%,表明方法回收率良好,見表7。

        表7 龍膽苦苷回收率

        2.7.4 檢測限與定量限

        龍膽苦苷的儀器檢測限為0.005483 μg/mL,定量限為0.01845 μg/mL。

        2.7.5 樣品含量測定

        精密吸取2.2中供試品溶液,按2.3中色譜條件進(jìn)行測定,得到龍膽苦苷化合物峰面積,以外標(biāo)法計算含量,結(jié)果見表8。

        表8 含量測定結(jié)果

        3 結(jié)論

        該方法建立了對三痹湯中的龍膽苦苷含量測定方法,通過方法學(xué)驗(yàn)證表明,該方法的精密度、穩(wěn)定性和回收率等均符合要求,可以用于三痹湯質(zhì)量龍膽苦苷的控制環(huán)節(jié)。

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