任夢(mèng)夢(mèng)，傅宏鑫，馬毅，王菊芳

（華南理工大學(xué)，廣東廣州 510006）

隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快，能源供需矛盾、生態(tài)環(huán)境惡化等問題日益突出[1]。一次性能源消耗持續(xù)增加，使用過程嚴(yán)重污染環(huán)境，產(chǎn)生氮氧化物、硫氧化物、一氧化碳、二氧化碳、甲烷以及有毒的粉塵等[2]。因此，節(jié)能減排面臨巨大挑戰(zhàn)，尋找綠色可再生的替代能源迫在眉睫。

生物質(zhì)能源具有資源豐富、分布廣泛、可再生、清潔、安全等優(yōu)點(diǎn)。地球上每年通過光合作用合成的生物質(zhì)約有1 800億噸，蘊(yùn)含其中的能量是世界能源消耗總量的10～15倍，但利用率低于3%，生物能源的開發(fā)利用，市場(chǎng)前景廣闊。生物燃料乙醇具有較高的辛烷值，享有“液體黃金”的美譽(yù)，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)療、國(guó)防和食品等領(lǐng)域。由于世界糧食緊缺，以糧食為原料生產(chǎn)第一代乙醇必將導(dǎo)致“與人爭(zhēng)糧、與糧爭(zhēng)地”的現(xiàn)象發(fā)生[3]，嚴(yán)重阻礙燃料乙醇的工業(yè)化發(fā)展。因此，利用“非糧”生物質(zhì)合成乙醇是最切實(shí)可行的生物燃料生產(chǎn)方式。

許多嗜熱厭氧菌能直接降解纖維素和半纖維素，這使得它們成為研究乙醇生產(chǎn)的熱點(diǎn)[4]。同時(shí)它們還具有如下一些優(yōu)勢(shì)：第一，具有廣泛的底物譜，能夠利用纖維素水解液中的五碳糖和六碳糖（主要是葡萄糖和木糖）；第二，對(duì)環(huán)境的耐受性較強(qiáng)，在較寬的pH和溫度范圍內(nèi)都能保持良好活性；第三，較高的操作溫度易于產(chǎn)物的分離純化且不易被污染。本課題組前期篩選得到一株嗜熱厭氧桿菌，鑒定為Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27[5]。通過阻斷嗜熱厭氧桿菌的乳酸合成途徑，獲得突變株T.aotearoense SCUT27Δldh的乙醇得率提高2倍[6]，而且其能夠高效利用木薯漿水解液為底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[7]。但是，游離細(xì)胞發(fā)酵時(shí)存在生長(zhǎng)能力較弱、糖耗速率慢與乙醇產(chǎn)量低等問題。

氮源是微生物生長(zhǎng)過程中必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，參與細(xì)胞內(nèi)許多代謝過程，可促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)胞內(nèi)初級(jí)代謝產(chǎn)物與次級(jí)代謝產(chǎn)物的比例，控制菌體的生長(zhǎng)速率，影響產(chǎn)物的生成與底物的消耗[8]。目前，乙醇發(fā)酵中常用的有機(jī)氮源為酵母提取物、胰蛋白胨、玉米漿、氨基酸等[9]。實(shí)驗(yàn)室中利用最廣泛的氮源是酵母提取物，因其能賦予菌株突出的發(fā)酵性能而廣為使用，胰蛋白胨作為一種速效氮源，也能顯著促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)。因此，本文分別以葡萄糖、木糖及混合糖為底物，探究酵母提取物和胰蛋白胨添加對(duì)嗜熱厭氧桿菌生產(chǎn)乙醇的影響，為其工業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用的菌株T.aotearoense SCUT27Δldh是通過同源重組雙交換方式敲除T.aotearoense SCUT27中乳酸脫氫酶基因（ldh）獲得，具有優(yōu)良的乙醇發(fā)酵性能[6]。

1.1.2 培養(yǎng)基配方

液體培養(yǎng)基采用嗜熱厭氧桿菌MTC培養(yǎng)基[10]。培養(yǎng)基成分均為分析純，其中酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜熱厭氧桿菌添加不同氮源的搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)

在搖瓶發(fā)酵MTC培養(yǎng)基中，分別以葡萄糖、木糖以及混合糖（葡萄糖、木糖的比例為2∶1）為底物，培養(yǎng)中分別添加1 g/L的酵母提取物、4 g/L的酵母提取物與2 g/L的胰蛋白胨、10 g/L的酵母提取物與5 g/L的胰蛋白胨，其余成分不變（以MTC培養(yǎng)基為對(duì)照）。將活化擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌株種子液于超凈工作臺(tái)內(nèi)按10%的接種量（V/V）接種到120 mL的血清瓶中，在55 ℃、150 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵，在發(fā)酵過程中每隔4 h取樣用于檢測(cè)菌株的生物量以及產(chǎn)物、底物的含量。

1.2.2 細(xì)胞密度的測(cè)定

測(cè)定細(xì)胞的生物量時(shí)，使用紫外可見分光光度計(jì)記錄其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光值。

1.2.3 產(chǎn)物和底物濃度的測(cè)定

將發(fā)酵樣品在高速離心機(jī)中以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后，取380 μL上清液和1 520 μL去離子水，并與100 μL濃度為10%（V/V）稀硫酸混勻，過濾除菌用高效液相色譜儀檢測(cè)并計(jì)算其含量。

使用高效液相色譜分析儀（HPLC，Waters 2695）檢測(cè)發(fā)酵液中各組分的含量，詳細(xì)參數(shù)如下：有機(jī)酸色譜柱為Aminex HPX-87P分離柱；檢測(cè)器為Milford RI-2414示差檢測(cè)器；流動(dòng)相為2.5 mmol/L H2SO4；流速為0.6 mL/min；柱溫箱溫度為60 ℃；檢測(cè)室溫度為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)氮源添加對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh利用葡萄糖發(fā)酵的影響

為了進(jìn)一步提高菌株的乙醇發(fā)酵性能，本研究對(duì)培養(yǎng)基有機(jī)氮源進(jìn)行了優(yōu)化。首先，以葡萄糖為底物，參照文獻(xiàn)[11]在MTC培養(yǎng)基中分別添加1 g/L酵母提取物、4 g/L酵母提取物與2 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物與5 g/L胰蛋白胨。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和表1所示，在MTC培養(yǎng)基中添加1 g/L酵母提取物時(shí)，T.aotearoense SCUT27Δldh的生物量、葡萄糖消耗量和乙醇濃度比對(duì)照分別提高24%、28%和34%，表明酵母提取物中的氮源、氨基酸和生長(zhǎng)因子等有效成分可以促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)和底物的消耗（表1）。然而，低濃度酵母提取物添加對(duì)乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度的提升不顯著。繼續(xù)增加酵母提取物濃度至4 g/L并補(bǔ)充適量的胰蛋白胨（2 g/L），T.aotearoense SCUT27Δldh的生物量、葡萄糖消耗量、乙醇濃度增加至5.47、21.90 g/L和7.52 g/L。值得一提的是，乙醇的生產(chǎn)強(qiáng)度是對(duì)照（MTC培養(yǎng)基）的2倍。當(dāng)酵母提取物與胰蛋白胨添加量分別達(dá)到10 g/L與5 g/L時(shí)，乙醇發(fā)酵性能無進(jìn)一步提升，以上結(jié)果表明適量無機(jī)氮源添加能顯著改善菌株生長(zhǎng)和葡萄糖的利用。

圖1 有機(jī)氮源添加對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh利用葡萄糖發(fā)酵的影響

表1 有機(jī)氮源對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的性能比較

2.2 有機(jī)氮源添加對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh利用木糖發(fā)酵的影響

木糖是世界上除葡萄糖外第二豐富的碳源，也是木質(zhì)纖維素水解液的主要成分[12-13]，因此本研究還考察了有機(jī)氮源對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響。結(jié)果如圖2和表2所示，與葡萄糖發(fā)酵相比，菌株利用木糖的能力較弱，如MTC培養(yǎng)基中細(xì)胞生物量?jī)H為1.99（葡萄糖發(fā)酵時(shí)生物量為2.62），底物消耗量和乙醇產(chǎn)量降低37%和41%，這一結(jié)果與木糖發(fā)酵產(chǎn)生較少ATP相一致。當(dāng)酵母提取物添加濃度為1 g/L時(shí)，菌株生物量和乙醇生產(chǎn)無顯著變化，說明菌株利用木糖發(fā)酵（相對(duì)于葡萄糖發(fā)酵）需要提供更為豐富的氮源。如預(yù)期的一樣，繼續(xù)增大酵母提取物濃度至4 g/L并添加2 g/L胰蛋白胨，T.aotearoense SCUT27Δldh OD600的生物量、木糖消耗量和乙醇濃度與對(duì)照（MTC培養(yǎng)基）相比，分別提高41%、50%和53%。與葡萄糖發(fā)酵類似，該條件下乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度與對(duì)照相比提高了91%，且繼續(xù)提高有機(jī)氮源添加對(duì)發(fā)酵性能提升無顯著影響。

2.3 有機(jī)氮源添加對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh利用混合糖發(fā)酵的影響

圖2 有機(jī)氮源添加對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh利用木糖發(fā)酵的影響

表2 有機(jī)氮源對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的性能比較

圖3 有機(jī)氮源添加對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh利用混合糖發(fā)酵的影響

表3 有機(jī)氮源對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh利用混合糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的性能比較

菌株T.aotearoense SCUT27Δldh的最大優(yōu)勢(shì)在于能利用木質(zhì)纖維素水解液中的葡萄糖和木糖，即木糖的利用沒有受到碳代謝阻遏的影響，因此最后本研究考察了有機(jī)氮源添加對(duì)T.aotearoense SCUT27Δldh混合糖（葡萄糖、木糖的比例為2∶1）發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響。發(fā)酵結(jié)果如表3和圖3所示，以混合糖為底物發(fā)酵的結(jié)果與葡萄糖和木糖發(fā)酵基本一致，T.aotearoense SCUT27Δldh的生長(zhǎng)，底物利用、乙醇產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度隨有機(jī)氮源濃度的提高而提高。在最佳氮源（4 g/L酵母提取物與2 g/L胰蛋白胨）條件下，細(xì)胞生物量、乙醇產(chǎn)量、得率與生產(chǎn)強(qiáng)度分別為5.18、7.58 g/L、0.36 g/g、0.38 g/L·h。值得一提的是，在MTC培養(yǎng)基和低濃度酵母提取物添加的MTC培養(yǎng)基中，發(fā)酵起始階段木糖的利用出現(xiàn)延遲（圖3A和3B），但是這一現(xiàn)象隨著氮源濃度的提高得到解決（圖3C和3D），表明混合糖的高效共利用需要充足的氮源供給。

綜上所述，無論是利用葡萄糖、木糖甚至是混合糖發(fā)酵，4 g/L酵母提取物與2 g/L胰蛋白胨對(duì)菌株的乙醇發(fā)酵性能促進(jìn)均最為顯著，且能有效提高乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度和實(shí)現(xiàn)混合糖共利用。

3 結(jié)論

針對(duì)嗜熱厭氧桿菌T.aotearoense SCUT27Δldh乙醇發(fā)酵存在生長(zhǎng)能力較弱、糖耗速率慢與乙醇產(chǎn)量低等問題，本文致力于通過優(yōu)化培養(yǎng)基的有機(jī)氮源組成和濃度來改善菌株的生長(zhǎng)、提高乙醇生產(chǎn)和底物利用能力，具體結(jié)論如下。

（1）以葡萄糖、木糖和混合糖為碳源時(shí)，在培養(yǎng)基中添加4 g/L酵母提取物與2 g/L胰蛋白胨時(shí)，乙醇發(fā)酵性能最佳，生產(chǎn)強(qiáng)度提升91%～111%。

（2）T.aotearoense SCUT27Δldh對(duì)木糖的利用能力低于葡萄糖，因此菌株在木糖和混合糖發(fā)酵時(shí)，充足的氮源供給有利于乙醇發(fā)酵性能的提升、實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖的高效共利用。