馬龍，邢軍，李安，張瑞

（1.新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830054；2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊830046）

0 引言

開菲爾粒是富含乳酸菌、酵母菌和醋酸菌的復(fù)雜微生物集合體[1]。開菲爾粒經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生有獨(dú)特香氣的酒精性功能飲料開菲爾[2]。在發(fā)酵的過程中，發(fā)酵乳中酵母菌的含量微小但是有很重要的作用，它們將糖與蛋白質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸、酒精等風(fēng)味物質(zhì)[3]。開菲爾粒中的酵母菌可與乳酸菌相互作用產(chǎn)生豐富的氨基酸和醇類物質(zhì)[4]。乳酸菌分解乳糖產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖，促使酵母菌生長而引起乙醇發(fā)酵，并產(chǎn)生CO2，酵母菌的生長繁殖為乳酸菌和醋酸菌的生長起促進(jìn)作用[5]。開菲爾粒的這種特殊的菌群結(jié)構(gòu)給予發(fā)酵乳特殊的風(fēng)味物質(zhì)，酵母菌的多樣性為發(fā)酵乳提供獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)發(fā)酵源[6]。酵母菌在有氧和無氧環(huán)境下都能生存，是單細(xì)胞真菌，屬兼性厭氧菌，以芽殖或裂殖方式進(jìn)行繁殖。酵母菌在釀造、醫(yī)藥、啤酒及發(fā)酵乳制品中起著重要作用[7]。

開菲爾在發(fā)酵過程中含有很多種酵母菌,酵母菌具有很高的營養(yǎng)價值，特別是含有較多蛋白質(zhì)，很多B族維生素、核酸和礦物質(zhì)，同時也能產(chǎn)生一些保健功能活性物質(zhì)。然而在酸奶中酵母菌的存在卻是不利的，往往被認(rèn)作酸奶中的污染菌，是酸奶變質(zhì)的主要原因[8]。但在一些商業(yè)化的乳制品中，特定的酵母能夠?yàn)楫a(chǎn)品帶來期望的香氣和風(fēng)味[9]。近年來，不斷發(fā)現(xiàn)酵母菌作為附屬發(fā)酵劑對乳制品發(fā)酵和成熟過程中的風(fēng)味影響、抑制有害菌的生長及對人體的潛在益生功能[10]。然而乳酸菌和酵母菌穩(wěn)定的互生關(guān)系比較復(fù)雜，既有促進(jìn)作用也有抑制作用，對于不同產(chǎn)品中它們?nèi)绾蜗嗷プ饔?，會產(chǎn)生哪些影響及共生機(jī)理目前還不十分清楚[11-12]。因此，研究酵母菌在整個發(fā)酵過程中的種群變化和豐度大小，有利于深入了解酵母菌與乳酸菌、醋酸菌等的生長和新陳代謝之間的相互影響。

1 微生物多樣性提取

使用m obio土壤微生物DNA強(qiáng)力提取試劑盒Power Soil?DNA Isolation K it。擴(kuò)增引物：真菌ITS1區(qū)域引物：（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。

儀器名稱、生產(chǎn)廠家和型號：微型離心機(jī)TIANGEN 1795、臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜海爾BC/BD-629HK、4°C冰箱 海爾HYC-360、振蕩器SIG 560E 96 well、PCR 儀 AB 9902、24孔 離 心 機(jī) EPPENDORF 5424E Q 766751。

試劑名稱及用量：基因組DNA 40-60 ng、*Vn F（10μm)1.5μL、*Vn R（10μm)1.5μL、Q 5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2μl、High GC Enhancer 10μL、Bμffer 10μL、dNTP 1μL、ddH2O、補(bǔ)至總體系50μL。反應(yīng)條件：95℃5 m in、95℃1 m in、50℃1min、72℃1 m in、72℃7 m in、4℃保存。

高通量測序委托北京百邁客生物科技有限公司。微生物多樣性是基于Illumina Hi Seq測序平臺，利用雙末端測序（Paired-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行測序。通過對Reads拼接過濾，OTUs（Operational Ta Jonomic Units）聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品的物種構(gòu)成和顯著物種差異分析等等。

圖1 發(fā)酵樣品PCR產(chǎn)物圖

2 結(jié)果分析

稀釋性曲線(Rarefaction Curve)從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計(jì)這些序列所代表的物種數(shù)目，并以序列數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線，用于驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。稀釋曲線可以作為對各樣本測序量是否充分的判斷,曲線急劇上升表明測序量不足，需要增加序列條數(shù)；反之，則表明樣品序列充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 發(fā)酵樣品序列信息

圖2 發(fā)酵樣品稀釋曲線

由圖2可知，隨著測序條數(shù)的加大，曲線趨于平緩，表示此環(huán)境中的物種并不會隨測序數(shù)量的增加而顯著增多，樣品測序科學(xué)合理。

2.1 PCoA結(jié)果分析

圖3 發(fā)酵樣品PCoA分析圖

由圖3可知，樣品在0 h樣本間比較集中，發(fā)酵24 h后，樣品間都分布在兩個區(qū)域。24 h、48 h、72 h的樣品，自身較分散，分布在不同坐標(biāo)，多樣性豐富。96 h和120 h的樣品自身集中，與其他時間段樣品間距離較小，自身樣品穩(wěn)定。樣品間重復(fù)性較好沒有太大差異。

2.2 各分類水平的分類學(xué)組成分析

圖4 發(fā)酵樣品門水平物種圖

2.3 門水平的群落分類學(xué)組成分析

真菌菌門優(yōu)勢菌門主要包括4個菌門，分別是子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、擔(dān)子霉門（Basidiobolomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）和未分類(Unclassified)。其中相對豐度最大的優(yōu)勢菌門為子囊菌門，高達(dá)69.38%，其相對豐度變化在不同發(fā)酵時間前后期依次為99.14%，99.78%，99.90%，99.95%，99.91%。其次被孢霉門相對豐度為6.91%，相對豐度變化依次為0.02%，0.06%，0.02%，0.00%，0.01%。由此可知，隨著發(fā)酵時間的增加子囊菌門的相對豐度總體呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，擔(dān)子菌門的相對豐度總體呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。其他3個菌門相對豐度較低，分別為擔(dān)子霉門0.02%、球囊菌門0.74%和壺菌門0.46%。

表2 發(fā)酵樣品物種占比表 %

2.4 屬水平上的群落構(gòu)成分析

占比在0.1%以上的真菌菌屬約30種。0.5%為Alternaria（20.77%）、ortierella（6.86%）、ladosporium（2.69%）、spergillus（1.71%）、lectosphaerella（1.70%）、ycosphaerella（1.37%）、andida（0.86%）、usarium（0.98%）、haetomium（0.91%）、uehomyces（0.93%）、idymella（0.58%），鏈格孢屬為相對優(yōu)勢菌屬，相對豐度變化在不同發(fā)酵時間前后期依次為20.77%，0.01%，0.01%，0.01%，0.01%，0.01%，其相對豐度在發(fā)酵溶液中逐漸降低。

圖5 發(fā)酵樣品門水平物種圖

表3 發(fā)酵樣品物種占比表 %

對于每個時間段樣品的酵母菌進(jìn)行門、屬等水平的歸類整理，未知的不做談?wù)?。在已知的樣品酵母菌中，酵母菌群落有差異。在發(fā)酵的前期，樣品中含有多種酵母菌，分別是子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、擔(dān)子霉門（Basidiobolomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）等5門的酵母菌。在屬水平下，有鏈格孢屬、毛殼菌屬、被孢霉屬、枝孢屬、曲霉屬、球腔菌屬、假絲酵母屬，鐮刀菌屬等30種酵母菌。

2.5 多樣性指數(shù)

表4 發(fā)酵樣品樣品多樣性指數(shù)

多樣性指數(shù)用于研究環(huán)境中微生物的多樣性，Shannon指數(shù)和Sim pson指數(shù)綜合衡量物種的多樣性，Shannon指數(shù)數(shù)值越高，Sim pson指數(shù)越低說明物種多樣性更豐富。樣品AJ000X的Shannon指數(shù)為0.0059，Sim pson指數(shù)為4.4516。說明樣品中酵母菌OTU多樣性很低，這些樣品在剛發(fā)酵時活化時間為24 h，活化前可能存放時間較長，或者因?yàn)樘赡虒?dǎo)致樣品真菌多樣性較低。在發(fā)酵24 h后，樣品中酵母菌進(jìn)一步活化，24 h Shannon指數(shù)為0.9493，Sim pson指數(shù)為0.1612，表明酵母菌多樣性開始增加。原因是其他類型的酵母菌開始繁殖。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)主要用于衡量樣本中的物種種類豐富度。Chao1指數(shù)主要利用只含有1條序列的OTU數(shù)目(singleton)和只含有2條序列的OTU數(shù)目(doubleton)來判斷群落的物種豐富度，它對單個物種的變化更為敏感，它的數(shù)值越大，表示物種種類越多；ACE指數(shù)是通過singleton和稀有物種(出現(xiàn)≤10次)來估算還有多少沒被發(fā)現(xiàn)的物種，當(dāng)測序中singleton的比例越大，ACE值越大，樣本的真實(shí)物種種類越多。樣品0 h的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均最高，表明這個樣品中酵母菌OTU種類較多；而樣品24 h、48 h、72 h的Chao1指數(shù)降低，ACE指數(shù)也隨著降低，表明樣品中酵母菌OTU種類慢慢變少。酵母菌數(shù)目在72 h最低，隨著發(fā)酵時間的增大，酵母菌的數(shù)目從24 h后一直在減少。說明在發(fā)酵的前期有大量的酵母菌分解乳糖，為乳酸菌的發(fā)酵提供能量和材料。在發(fā)酵的后期，酵母菌菌落數(shù)目減少。Sim pson指數(shù)值很低，說明群落多樣性越低，Shannon值越來越小，說明群落多樣性變低。

2.6 豐度熱圖分析

由圖6可以看出，新疆阿勒泰發(fā)酵劑開菲爾粒中0 h酵母菌的種類和數(shù)量都特別多，門水平上面包含子囊菌門、擔(dān)子菌門、球囊菌門等。屬水平上面假絲酵母屬、鐮刀菌屬、擬青霉屬、綠僵菌屬、漆斑菌屬、錐毛殼屬、毛殼菌屬、腐質(zhì)霉屬、擲孢酵母、角擔(dān)子菌屬、紅酵母屬、被孢霉屬、附球菌屬等十七種屬的真菌。

圖6 發(fā)酵樣品豐度熱圖

在發(fā)酵24 h后，菌群發(fā)生了變化。出現(xiàn)了紅酵母屬、擲孢子酵母屬、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、尾孢屬、假絲酵母、鏈孢霉屬。在48 h出現(xiàn)了擲孢酵母屬、克魯維酵母菌屬、覆膜孢酵母屬、毛霉屬、紅酵母屬、鐮刀菌屬、毛殼屬、腐質(zhì)菌屬、金擔(dān)子菌屬、球腔菌屬、假絲酵母、附球菌屬。在72 h出現(xiàn)了毛殼菌屬、被毛孢屬、鐮刀菌屬、金擔(dān)子、曲霉屬、霉菌屬、紅酵母屬、德巴里酵母菌、克魯維酵母菌、葡萄球菌屬、（附球）菌屬。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室將采集與新疆阿勒泰地區(qū)的發(fā)酵劑開菲爾粒和牛乳為原料，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。分時段檢測在不同時間段，發(fā)酵乳中酵母菌的變化規(guī)律。18個樣品的真菌ITS1區(qū)測序，得到1440062對Reads'，過濾后共產(chǎn)生1259185條C lean tags，每個樣品至少產(chǎn)生48385條C lean tags。平均產(chǎn)生69955條C lean tags。在這些樣品中，以0 h的樣品的多樣性最為明顯，在發(fā)酵初期，有三個門的酵母菌，子囊菌門、擔(dān)子菌門、球囊菌門等。屬水平：假絲酵母屬、鐮刀菌屬、擬青霉屬、綠僵菌屬、漆斑菌屬、錐毛殼屬、毛殼菌屬、腐質(zhì)霉屬、擲孢酵母、角擔(dān)子菌屬、紅酵母屬、被孢霉屬、附球菌屬等十七種屬。其中，優(yōu)勢菌門是子囊菌門，鏈格孢屬屬為優(yōu)勢菌屬。

4 討論

高通量測序技術(shù)近幾年在食品分析方面用途寬廣，但是分析乳制品中真菌多樣性的報道較少，本研究的乳制品中真菌菌群復(fù)雜性雖然沒有腸道，土壤等多，但是乳制品中的菌群直接決定發(fā)酵乳的品質(zhì)和風(fēng)味，不僅關(guān)系到乳制品的制作同時對乳制品的運(yùn)輸保存也有影響。劉建利等研究面引子中酵母菌，結(jié)果表明樣品中共有12個屬16種酵母菌，用高通量測序研究新疆傳統(tǒng)馕面團(tuán)發(fā)酵酵母菌，研究發(fā)現(xiàn)10個屬14個種[13-15]。本研究對開菲爾發(fā)酵液發(fā)酵過程的真菌群落多樣性和豐富度進(jìn)行分析與評價，其中在前期樣品中豐富度和多樣性最大，在后期樣品中較低，前后期之間存在差異。通過對發(fā)酵過程的現(xiàn)象觀察發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中溶液表面的真菌數(shù)量逐漸減少，且在發(fā)酵前期溶液的澄清度差別不明顯，到發(fā)酵后期溶液的澄清度有明顯差異，前期溶液濃稠暗淡，后期溶液較清。后期溶液豐富度和多樣性的趨勢變化可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵前期溶液中的溶解氧被逐漸消耗使好氧菌數(shù)量減少，在發(fā)酵后期上層菌群逐漸沉降，使發(fā)酵后期溶液中的菌群豐富度和多樣性差異逐漸減小[16-20]。

開菲爾發(fā)酵液樣品進(jìn)行分類學(xué)鑒定時發(fā)現(xiàn)真菌群落主要包括5個門，其中子囊菌門（74.21%）為優(yōu)勢菌門。張穎[21]研究證明，豆醬自然發(fā)酵的不同階段優(yōu)勢真菌是子囊菌門，同時在李恒等[22-23]研究的泡菜母水中子囊菌門（99.93%）也是優(yōu)勢菌門，說明子囊菌門在發(fā)酵過程中起著極大的共性作用。因此，結(jié)合測序結(jié)果與觀察結(jié)果推測發(fā)酵液表面的青灰色真菌可能是韋斯特殼屬和青霉屬，后期將對這2個種屬及占比在2%以上的曲霉屬、鏈格孢屬進(jìn)行分離純化。

開菲爾發(fā)酵液中有著豐富的微生物資源，具有生物學(xué)多樣性。本實(shí)驗(yàn)僅利用高通量測序技術(shù)分析開菲爾發(fā)酵液中真菌菌群結(jié)構(gòu)、豐富度與多樣性的動態(tài)變化，比較客觀地反映出開菲爾發(fā)酵液中的真菌區(qū)系[24-27]?？紤]到開菲爾發(fā)酵液的成分屬于多菌種混合發(fā)酵，酵母菌發(fā)酵液也含有風(fēng)味性成分，發(fā)酵過程中真菌結(jié)構(gòu)、豐富度與多樣性的變化勢必會對開菲爾發(fā)酵液中的風(fēng)味成分產(chǎn)生影響，因此后期將對傳統(tǒng)開菲爾發(fā)酵液發(fā)酵過程中菌種變化與風(fēng)味物質(zhì)之間的聯(lián)系深入研究。