米凱 黃銳（通訊作者）

（1核工業(yè)四一六醫(yī)院<成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院>普外科 四川 成都 610501）

（2四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院<四川省人民醫(yī)院> 四川 成都 610072）

肝細(xì)胞癌（hePatocellular carcinoma，HCC）病情隱匿，早期極難發(fā)現(xiàn)，95%的患者在確診時(shí)已為晚期[1]。由于肝癌細(xì)胞對(duì)放化療藥物具有一定抗性，目前除了早期手術(shù)切除外，尚無(wú)有效治療方法[2]。肝癌產(chǎn)生的本質(zhì)歸結(jié)于細(xì)胞程序性死亡被阻斷導(dǎo)致的細(xì)胞無(wú)限增殖，因此誘導(dǎo)癌變細(xì)胞重新進(jìn)入凋亡和生長(zhǎng)抑制途徑將給肝癌治愈帶來(lái)根本性改變[3]。研究表明，花椒提取物具有止痛、抗氧化、抗炎、還原劑等作用的同時(shí)還具有抗腫瘤作用[4]。但有關(guān)花椒提取物對(duì)肝癌細(xì)胞的作用報(bào)道少見(jiàn)，因此，本實(shí)驗(yàn)研究花椒提取物對(duì)人肝癌HePG2細(xì)胞增殖、凋亡及Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響，為探索肝癌的高效靶向治療聯(lián)合用藥提供新思路。

1.資料與方法

1.1 花椒提取物制備

花椒（原產(chǎn)地四川）仔細(xì)剔除花椒種子等雜質(zhì)，稱取200g，經(jīng)無(wú)菌蒸餾水沖洗后經(jīng)75%酒精沖洗一次，投入4000mL 75%酒精室溫浸泡24h后過(guò)濾，棄濾渣，得浸出液，將浸出液減壓蒸餾后獲得濃縮原液，使用真空冷凍干燥機(jī)對(duì)原液進(jìn)行冷凍干燥，得粉末，置入干燥器備用。精密天平準(zhǔn)確稱量200mg干燥粉末用1mL二甲基亞砜（DMSO）溶解，0.22μm一次性濾器過(guò)濾除去不溶解雜質(zhì)，得ZMBE，放入4℃冰箱保存，使用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋ZMBE藥物到所需濃度[5]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HePG2肝癌細(xì)胞（南京凱基生物）在含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于溫度37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分成對(duì)照組和ZBME組。對(duì)照組加入DMSO，花椒提取物組加入溶解于DMSO的ZBME：8μg/mL，37℃孵育48h后，收集所有細(xì)胞。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取收集的細(xì)胞，按照CCK-8檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶生物）說(shuō)明檢測(cè)，將各組細(xì)胞按每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，加入100μL完全培養(yǎng)液于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48h后，每孔加入10μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在450nm處的吸光度值（A），細(xì)胞增殖活力（%）=（A實(shí)驗(yàn)組-A對(duì)照組）/A對(duì)照組×100%。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取收集的細(xì)胞，按Annexin V-PI說(shuō)明書(shū)（北京索萊寶生物）檢測(cè)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以5×105/mL的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48h后取出6孔板，用PBS清洗細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)液，常規(guī)重懸后加入AnnexinV APC、7-AAD，輕輕搖動(dòng)，使其混合均勻，室溫避光孵育15min，上流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD）檢測(cè)，總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

采用RNA提取試劑盒（Invitrogen）提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定A260和A280吸光度值，電泳確定RNA的完整性后，依據(jù)mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，合成cDNA，用PCR儀擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進(jìn)行分析對(duì)比，采用2-ΔΔCt對(duì)血紅素加氧合酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶-1（NQO1）、ARE mRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 花椒提取物對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響

細(xì)胞增殖、凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，花椒提取物組的細(xì)胞增殖顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；細(xì)胞凋亡花椒提取物組顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；見(jiàn)表1，圖1。

表1 不同處理組細(xì)胞增殖、凋亡比較（）

表1 不同處理組細(xì)胞增殖、凋亡比較（）

組別 n 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡花椒提取物組 3 0.77±0.02** 14.94±1.58**對(duì)照組 3 1.01±0.05 5.63±0.92 t 10.090 8.802 P＜0.001 0.001

圖1 細(xì)胞凋亡

2.2 花椒提取物對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路因子的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，花椒提取物組的HO-1、NQO1、ARE mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同處理組HO-1、NQO1、ARE mRNA表達(dá)

3.討論

肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)生發(fā)展是由多步驟、多因素、多基因共同參與而導(dǎo)致的結(jié)果，其與肺癌、胰腺癌一起被稱為病死率最高的三大癌癥[6]。目前臨床治療晚期肝癌靶向藥物價(jià)格昂貴，給我國(guó)眾多肝癌患者治療帶來(lái)極大不便。因此，本研發(fā)具有良好抗肝癌效果且適合我國(guó)國(guó)情的藥物，為肝癌治療提供依據(jù)。

花椒具有較高的食用和藥用價(jià)值，其具有較強(qiáng)的抗氧化性、消除自由基、抗腫瘤效果[5]。目前已證實(shí)花椒提取物可以誘導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞凋亡[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示花椒提取物具有直接抑制肝癌HePG2細(xì)胞的作用，CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)花椒提取物組的細(xì)胞增殖顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色觀察到細(xì)胞凋亡花椒提取物組顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。提示花椒提取物抑制肝癌HePG2細(xì)胞的增殖并促進(jìn)肝癌HePG2細(xì)胞的凋亡是其抑制肝癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的主要途徑之一。

Nrf2/ARE信號(hào)通路能夠啟動(dòng)下游多種保護(hù)性基因的表達(dá)，已證實(shí)Nrf2/ARE信號(hào)路徑調(diào)節(jié)的可編碼內(nèi)源性保護(hù)基因超過(guò)200個(gè)[8]。ARE是一個(gè)特異的DNA-啟動(dòng)子結(jié)合序列，其可保護(hù)細(xì)胞組織正常功能。HO-1可與其酶降解產(chǎn)物共同發(fā)揮抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等作用，是機(jī)體最重要的內(nèi)源性保護(hù)體系之一。NQO1是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)處于氧化還原狀態(tài)的黃素酶，對(duì)各種代謝引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有保護(hù)作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，花椒提取物組的HO-1、NQO1、ARE mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），提示花椒提取物可激活Nrf2/ARE信號(hào)通路。

綜上所述，花椒提取物可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，并激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，達(dá)到抗癌作用。但由于花椒提取物成分復(fù)雜，含量不一，其具體的抗腫瘤作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。