李林 慕玉東（通訊作者） 賀林 張濤 袁志敏 代佳 秦浩 劉斯揚(yáng)

（1陜西省腫瘤醫(yī)院 陜西 西安 710061）

（2西安市中心醫(yī)院 陜西 西安 710003）

近年來，伴隨著我國經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展及工業(yè)化進(jìn)程不斷加快，人口老齡化加劇，每年肺癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，負(fù)擔(dān)日益加重。我國肺癌的發(fā)病率及死亡率已居所有惡性腫瘤之首，其中男性發(fā)病率和死亡率居第一位，女性的發(fā)病率居第二位，但其死亡率仍居第一位[1]。如何提高治療肺癌的效果以及肺癌的存活率，一直以來都是醫(yī)學(xué)界探討和研究的問題，中醫(yī)中藥在治療腫瘤方面成為了研究熱點(diǎn)。青藤堿（Sinomenine，SIN）是防己科植物青風(fēng)藤的根和莖中的有效成分，具有抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降血壓及治療心律失常的作用[2]，它還有抑制細(xì)胞周期引起腫瘤細(xì)胞的凋亡[3]，具有抗腫瘤的作用，但是青藤堿對小細(xì)胞肺癌是否有抑制作用仍不清楚。本研究觀察青藤堿對小細(xì)胞肺癌對NCI-H446的影響，并探討其機(jī)制，為小細(xì)胞肺癌的治療提供理論依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446（武漢博士德生物工程有限公司）；青藤堿(安賽邦醫(yī)藥科技有限公司)；5-FUR(批號(hào)：20101112，江蘇省南通市海爾斯藥業(yè))；F12K培養(yǎng)基（武漢博士德公司）；胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，美國Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將NCI-H446細(xì)胞接種于含10%熱滅活新生小牛血清、1%雙抗（青霉素10KU/L和鏈霉素10mg/L）的F12K培養(yǎng)液中，置于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱。細(xì)胞呈單層貼壁生長，實(shí)驗(yàn)和傳代均取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446，用含10%胎牛血清及1%雙抗（青霉素10KU/L和鏈霉素10mg/L）的F12K培養(yǎng)基調(diào)成1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔200μL，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)基，加入100μL新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)液與100μL不同濃度的青藤堿溶液（濃度分別為50、100、150、200、250μg/ml），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)12、24、36h后，每孔加入MMT20μ L(5mg/ml)。再用酶標(biāo)儀于490nm處測定吸光度值，計(jì)算藥物對NCI-H446的增殖抑制率，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（LC50）。細(xì)胞抑制率=（陰性對照組A490nm－實(shí)驗(yàn)組A490nm）/陰性對照組A490nm×100%，重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 調(diào)整細(xì)胞濃度25cm2培養(yǎng)瓶中(coming)，每瓶106個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，再于4℃培養(yǎng)2h，吸棄培養(yǎng)液并加入含青藤堿50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml 不同濃度的培養(yǎng)基2.5ml，作用12h、24h、36h后收集細(xì)胞，經(jīng)固定后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；Binding Buffer，Annex in v染色后檢測細(xì)胞凋亡率和死亡率,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 SIN對NCI-H446細(xì)胞增殖的抑制作用

SIN濃度＜100μg/ml對NCI-H446細(xì)胞的增殖無明顯抑制。隨著SIN濃度的升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長，其對細(xì)胞增殖的抑制明顯增強(qiáng)，有著顯著的時(shí)間－劑量效應(yīng)關(guān)系（圖1）。SIN 250μg/ml培養(yǎng)36h，其抑制率最大為85.67%。

圖1 青藤堿不同濃度對NCI-H446細(xì)胞增殖的抑制

2.2 SIN對NCI-H446細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞Annexin V/PI檢測細(xì)胞凋亡分析顯示，不同濃度的SIN培養(yǎng)36h，隨著SIN濃度的升高，早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例都在逐漸增加，與對照組相比其差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

3.討論

近年來，我國肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已經(jīng)成為致死的主要惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康。尤其小細(xì)胞肺癌，占肺癌的15%，其特征是倍增時(shí)間短，侵襲能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)移早而廣泛，惡性程度高，預(yù)后差。大多數(shù)小細(xì)胞肺癌患者在診斷時(shí)已經(jīng)是晚期，只能采取化療結(jié)合放療的治療方案，治療效果不理想，而且有著極大的副作用。因此，中醫(yī)中藥治療腫瘤成為了臨床上必要的選擇。已有研究證明青藤堿對肝癌、乳腺癌、宮頸癌等具有抗增殖、抗腫瘤的作用[4-7]，但青藤堿對小細(xì)胞肺癌是否有抑制作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)探討青藤堿的抗腫瘤作用，以小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為研究對象，對其作用的機(jī)制進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青藤堿有顯著的促進(jìn)人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長，而且隨著SIN濃度的升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長，呈現(xiàn)了濃度依賴性和時(shí)間依賴性。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為青藤堿對人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞生長、增殖有明顯的抑制作用并促進(jìn)其凋亡，作為中藥提取的有效成分，它具有較小的毒副作用及良好的抗腫瘤作用，在目前常規(guī)的放化療基礎(chǔ)上結(jié)合青藤堿中藥輔助治療，進(jìn)一步提高小細(xì)胞肺癌的治療效果，從而改善患者的預(yù)后，青藤堿具有較好的臨床應(yīng)用前景。