曹勤洪, 吳震峰, 吳曉宇, 陳徹, 姚學(xué)權(quán), 劉福坤, 陳玉根

新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)切除的治療方案能顯著改善局部進展期直腸癌患者的局部復(fù)發(fā)和總體生存[1-2]。但由于新輔助放化療反應(yīng)的個體差異,并不是所有的直腸癌患者都能從新輔助放化療中獲益。腫瘤對放療耐受的機制非常復(fù)雜,臨床通過改進放療方案、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)和聯(lián)合其他治療等方法以減少腫瘤對放療的抵抗[3]。

直腸癌中,目前廣泛應(yīng)用的放療增敏劑為5-FU類化療藥,但其存在一定毒副作用,且療效有限[2]。研究顯示多種中藥有提高放療敏感性的作用[4-5]。華蟾毒精為中華大蟾蜍皮的有效中藥單體提取物,可抑制多種腫瘤細胞生長[6-7]。華蟾素是中華大蟾蜍的初提物,研究發(fā)現(xiàn)對肝癌細胞具有放療增敏作用[8]。華蟾毒精對于直腸癌的放射治療增敏作用,鮮有報道。本研究選用人結(jié)直腸癌細胞系SW-480、HT-29、HCT-116為研究對象,采用CCK8檢測細胞增殖,并用流式細胞儀測定細胞周期和凋亡變化,研究華蟾毒精在人結(jié)直腸細胞放療中的增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備 SW-480、HT-29、HCT-116細胞株購于上海中國科學(xué)院細胞庫;DMEM培養(yǎng)基(批號:AB10104399)購于美國Hyclone公司;華蟾毒精(批號:Z01D7X25885)購于源葉生物;CCK8(批號:EG20161117)購于南京恩晶生物公司;碘化丙啶(批號:BKCA08)購于南京拜睿生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(批號:KGA108)購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;XD-101型CO2培養(yǎng)箱購于日本Sanyo公司;IX51型生物倒置顯微鏡購于日本Olympus公司;RT-6000型酶標(biāo)儀購于丹麥Radiometer公司;SPECTRA max Plus 384型酶標(biāo)儀購于美國Molecular Devices公司;FACS Calibur型流式細胞儀購于美國Becton-Dickinson;RS2000Pro型生物輻照儀購于美國Radsource公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組處理 人結(jié)直腸癌SW-480、HT-29、HCT-116細胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)細胞,調(diào)整細胞狀態(tài)達到對數(shù)生長期。分為正常對照組、X射線輻射組(16 Gy)、華蟾毒精組(華蟾毒精:100 ng/ml)及華蟾毒精和X射線輻射聯(lián)合組(華蟾毒精100 ng/ml處理4 h后,X射線16 Gy輻照30 min)。

1.3 CCK8檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期細胞,37 ℃,0.25%胰酶(含EDTA)消化細胞2 min;收集細胞,1 000 rpm離心5 min;離心后棄上層培養(yǎng)液,加入4 ml新鮮培基,吹打混勻;取細胞懸液20 μl,加20 μl臺盼藍溶液,細胞計數(shù),細胞存活率需在90%以上;顯微鏡計數(shù),調(diào)整細胞濃度為4 000個/100 μl;取96孔板,密度為4 000/孔;置細胞培養(yǎng)箱,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)過夜(16～24 h)。各組細胞在上述處理后24 h、48 h、72 h取出96孔板,棄去細胞上層培基,每孔加入100 μl 含0.5%FBS的新鮮培養(yǎng)基,再每孔加入10 μl CCK8,37 ℃孵育4 h。將96孔板放入酶標(biāo)儀,450 nm進行讀數(shù)。結(jié)果以細胞存活率表示表示。細胞存活率=(實驗吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.4 Annexin V/PI雙染色流式細胞儀檢測細胞凋亡 各組細胞處理48 h,取出6孔板,把細胞培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi),PBS 洗滌貼壁細胞1次,加入適量胰酶細胞消化后收集細胞。用 PBS 輕輕重懸細胞并計數(shù)。取1×105個重懸的細胞,用PBS洗滌2次后加入 500 μl平衡緩沖液,加入5 μl Annexin V-FITC混勻后,加入5 μl碘化丙啶,輕輕混勻。室溫(20～25℃)避光孵育15 min。進行流式細胞儀檢測,Annexin V-FITC為綠色熒光,PI 為紅色熒光。FITC的綠色熒光激發(fā)波長為 488 nm,在 FL1 通道檢測;PI 的紅色熒光在 FL2 通道檢測。用 Cell Quest 等軟件進行分析,繪制雙色散點圖,FL1 為橫坐標(biāo),FL2 為縱坐標(biāo)。每個樣采集 10 000個信號。

1.5 流式細胞檢測細胞周期 收集細胞懸液到離心管內(nèi),4 ℃,1 000 g離心后用預(yù)冷至4 ℃的PBS重懸洗滌3次,加入 1 ml預(yù)冷75%乙醇,4 ℃固定過夜。每個待檢細胞樣品中加入500 μl配制好的PI染色工作液,輕輕重懸細胞沉淀,置于37 ℃避光水浴。用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光,同時檢測光散射情況。軟件分析細胞周期相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 華蟾毒精、X射線及華蟾毒精和X射線聯(lián)合應(yīng)用對SW-480、HT-29、HCT-116細胞存活率的影響

如圖1所示,與對照組相比,單獨X射線輻照和單獨華蟾毒精給藥,HT-29和HCT-116細胞的存活率均降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),但對SW-480細胞的存活率無影響,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);聯(lián)合應(yīng)用華蟾毒精和X射線可降低SW-480、HT-29、HCT-116這3種細胞的存活率,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),且聯(lián)合應(yīng)用華蟾毒精和X射線組3種細胞存活率與單獨X射線輻照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

圖1A 華蟾毒精、X射線對SW-480、HT-29、HCT-116細胞存活率的影響1A：華蟾毒精組、 X射線組SW-480細胞存活率與對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組中SW-480細胞存活率與對照組、X射線輻射組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05); 1B:華蟾毒精組、 X射線組及華蟾毒精和X射線聯(lián)合組中HT-29細胞存活率與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組中HT-29細胞存活率與X射線輻射組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 1C：華蟾毒精組、 X射線組及華蟾毒精和X射線聯(lián)合組HCT-116細胞存活率與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組HCT-116細胞存活率與X射線輻射組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

2.2 華蟾毒精和X射線聯(lián)合應(yīng)用對人結(jié)直腸SW-480、HT-29和HCT-116細胞凋亡的影響 如表1及圖2所示,與對照組相比,單獨華蟾毒精處理(100 ng/ml)和單獨X射線(16 Gy)均能引起人結(jié)直腸SW-480、HT-29和HCT-116細胞的凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與單獨X射線處理相比,聯(lián)合應(yīng)用華蟾毒精和X射線處理三種細胞凋亡率均增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 華蟾毒精和X射線對SW-480、HT-29、HCT-116細胞凋亡的影響

分組凋亡率(%) SW480 對照組2.27±0.33 華蟾毒精組12.85±0.59? X射線組10.32±0.44? 華蟾毒精+X射線組15.87±0.63?# HT-29 對照組2.65±0.32 華蟾毒精組32.38±0.77? X射線組6.98±0.37? 華蟾毒精+X射線組16.43±0.69?# HCT-116 對照組3.14±0.28 華蟾毒精組30.1±0.55? X射線組4.38±0.38? 華蟾毒精+X射線組16.53±0.59?#

注:*為與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);#為與X射線組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

2.3 流式細胞儀測定細胞周期變化 見圖3。細胞周期檢測結(jié)果所示,與對照組相比,3種細胞株的相應(yīng)處理組的細胞周期均發(fā)生了改變,但3種細胞株的變化并不相同。華蟾毒精處理組與對照組相比:SW-480細胞株G1期細胞比例未發(fā)生改變(P=0.146),見圖3A-2;HT-29細胞株G1期和S期細胞比例均發(fā)生改變(G1期:P<0.001;S期:P<0.001),見圖3B-2;HCT-116細胞株G1期、S期以及G2期細胞比例均發(fā)生了改變(G1期:P<0.001;S期:P<0.001;G2期:P<0.001),見圖3C-2。

圖2 華蟾毒精和X射線對SW-480、HT-29、HCT-116細胞凋亡的影響2A1～2A4:華蟾毒精和X射線對SW-480細胞凋亡的影響 2A-1為對照組,2A-2為華蟾毒精組,2A-3為X射線組,2A-4為華蟾毒精+X射線組;2B1～2B4:華蟾毒精和X射線對HT-29細胞凋亡的影響 2B-1為對照組,2B-2為華蟾毒精組,2B-3為X射線組,2B-4為華蟾毒精+X射線組;2C1～2C4:華蟾毒精和X射線對HCT-116細胞凋亡的影響 2C-1為對照組,2C-2為華蟾毒精組,2C-3為X射線組,2C-4為華蟾毒精+X射線組

X射線組使SW-480細胞阻滯于G1期(圖3A-3),聯(lián)合華蟾毒精,仍使細胞阻滯于G1期(圖3A-4),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>-0.05);X射線使HT-29細胞阻滯于G2期(圖3B-3),但聯(lián)合華蟾毒精后使細胞同時阻滯于G1期和G2期(圖3B-4),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且S期細胞減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);X射線使HCT-116細胞阻滯于G1期(圖3C-3),聯(lián)合華蟾毒精時仍使細胞阻滯于G1期(圖3C-4),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

如上所述,華蟾毒精對SW-480細胞周期影響不明顯,X射線使SW-480細胞阻滯于G1期,X射線聯(lián)合華蟾毒精組與X射線組的細胞周期無明顯差異;華蟾毒精使HT-29細胞主要阻滯于S期,X射線使HT-29細胞阻滯于G2期,X射線聯(lián)合華蟾毒精使HT-29細胞阻滯于G1期和G2期,聯(lián)合組與X射線組的細胞周期相比,G1期細胞比例顯著增加,而S期細胞比例明顯減少;華蟾毒精使HCT-116細胞阻滯于G2期,X射線使HCT-116細胞阻滯于G1期,X射線聯(lián)合華蟾毒精使HCT-116阻滯于G1期,聯(lián)合組與X射線組細胞周期相比,無明顯差異。

圖3 華蟾毒精和X射線對SW-480、HT-29、HCT-116細胞周期的影響3A-1～3A4:華蟾毒精和X射線對SW-480細胞周期的影響3A-1為對照組;3A-2為華蟾毒精組;3A-3為X射線組;3A-4為華蟾毒精和X射線聯(lián)合組。華蟾毒精組與對照組相比,G1期、S期和G2期細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(G1期:P=0.146;S期:P=0.062;G2期:P=0.133);X射線組與對照組相比,G1期細胞比例,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組與X射線輻射組相比,G1期細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.232) 3B-1～3B-4:華蟾毒精和X射線對HT-29細胞周期的影響3B-1為對照組;3B-2為華蟾毒精組;3B-3為X射線組。3B-4為華蟾毒精和X射線聯(lián)合組。華蟾毒精組與對照組相比,G1期和S期細胞比例,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(G1期:P<0.001;S期:P<0.001),而G2期細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.203);X射線組與對照組相比,G2期細胞比例,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組與X射線輻射組相比,G1期細胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001),且S期細胞比例,差異亦有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001) 3C-1～3C-4:華蟾毒精和X射線對HCT-116細胞周期的影響3C-1為對照組;3C-2為華蟾毒精組;3C-3為 X射線組;3C-4為華蟾毒精和X射線聯(lián)合組。華蟾毒精組與對照組相比,G1期、S期以及G2期細胞比例,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(G1期:P<0.001;S期:P<0.001;G2期:P<0.001);X射線組與對照組相比,G1期細胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001);華蟾毒精和X射線聯(lián)合組與X射線輻射組相比,G1期細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.201)

3 討論

蟾酥是我國重要的傳統(tǒng)中藥材,臨床應(yīng)用廣泛,可應(yīng)用于止痛、強心及抗腫瘤[9]。蟾酥主要抗腫瘤活性成分為華蟾毒精[10]。華蟾毒精中成藥包括膠囊劑和注射劑,在國內(nèi)已單獨、聯(lián)合化療或聯(lián)合放療用于多種腫瘤治療。其單獨應(yīng)用于結(jié)直腸癌[11]、胃癌[12]、肝癌[8,13]體現(xiàn)了明顯的抗癌療效,聯(lián)合放射應(yīng)用于中晚期鼻咽癌[14]、食管癌[15]、肺癌[16],效果亦佳。

體外實驗研究發(fā)現(xiàn),華蟾毒精可以增加肝癌Bel-7402細胞的凋亡,抑制NF-κB 活化,并增強其放療敏感性[8]。在對食管癌研究中發(fā)現(xiàn),華蟾毒精能通過P73信號通路抑制細胞周期并促進細胞凋亡[17]。而P73可以被酪氨酸激酶c-Abi調(diào)節(jié),并參與放療相關(guān)DNA損傷引起的細胞凋亡過程[18]。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)華蟾毒精可以通過ROS/MAPK信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡, 而ROS/MAPK信號通路參與細胞放療耐受的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。

本研究結(jié)果顯示X射線、華蟾毒精能抑制HT-29及HCT-116細胞株增殖(P<0.05),但對SW-480細胞株抑制作用較弱(P>0.05),說明SW-480對華蟾毒精及X射線具有耐受性。華蟾毒精和X射線聯(lián)合作用時,不僅放療敏感細胞株(HT-29、HCT116)的增殖明顯受抑制(P<0.05),而且放療耐受的SW-480細胞株亦顯示出顯著的增殖抑制作用P<0.05)。而華蟾毒精和X射線聯(lián)合作用時三種結(jié)直腸癌細胞的增殖均明顯低于X射線組(P<0.05)。因此華蟾毒精不僅能增加放療敏感結(jié)直腸癌細胞的放療敏感性,并且能逆轉(zhuǎn)放療耐受結(jié)直腸癌細胞的放療敏感性。本研究還發(fā)現(xiàn),與對照組相比,華蟾毒精能增加SW-480[(12.85±0.59)比(2.27±0.33),P<0.05)]、HT-29[(32.38±0.77)比(2.65±0.32),P<0.05)]以及[HCT-116(30.1±0.55)比(3.14±0.28),P<0.05)]的細胞凋亡,因此華蟾毒精可能通過增加結(jié)直腸細胞凋亡而起到放療增敏作用。另外,本研究發(fā)現(xiàn)華蟾毒精對SW-480、HT-29以及HCT-116三種細胞株的細胞周期作用并不相同,與對照組相比,華蟾毒精對SW-480的細胞周期影響不明顯(P>0.05),但能使HT-29細胞阻滯于S期(P<0.05),使HCT-116阻滯于G2期(P<0.05)。如前所述,華蟾毒精對SW-480的增殖抑制作用不明顯,但能增加SW-480的細胞凋亡,因此華蟾毒精可能是通過增加SW-480的細胞凋亡起到放療增敏作用,而非通過細胞周期抑制作用。而對于HT-29以及HCT-116細胞,華蟾毒精可能同時通過增加細胞凋亡和抑制細胞周期起到放療增敏作用。

綜上,華蟾毒精能夠增加人結(jié)直腸癌SW-480、HT-29及HCT-116的凋亡,并增強其放療敏感性,可作為結(jié)直腸癌放療的輔助治療。