黃欣昊， 柳千帆， 宋春灼， 朱海濤

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 臨床研究中心,貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽 550004)

胰腺癌是一種化學(xué)治療效果差、對絕大多數(shù)化療藥物都不敏感的難治性惡性腫瘤[1-3]。與近年來大多數(shù)腫瘤生存率穩(wěn)定增長趨勢相反，胰腺癌患者的死亡率逐年增加，且晚期胰腺癌患者5年生存率僅達(dá)3%[4-5]。1996年，吉西他濱(gemcitabine，GEM)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于胰腺癌治療[6]，至今依然是胰腺癌治療的一線化學(xué)治療藥，但對患者的生存期及總生存率并沒有明顯的提高[7-8]；厄洛替尼(erlotinb，ERL)是目前臨床上唯一與GEM聯(lián)用后對患者有生存優(yōu)勢的分子靶向藥物[9-11]。本課題前期研究結(jié)果表明，GEM聯(lián)合ERL可以改善患人胰腺癌腫瘤裸鼠的生存狀態(tài)，并延長其中位生存期[12]。為進(jìn)一步探究GEM與ERL合用治療胰腺癌的分子機(jī)制，本研究通過雙染流式細(xì)胞技術(shù)觀察不同藥物處理后人胰腺癌細(xì)胞PANC-1細(xì)胞的凋亡情況，運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR法觀察p53基因的表達(dá)，同時通過Western Blot法觀察p53及其信號通路下游重要生物分子BAX蛋白表達(dá)水平，以探究GEM聯(lián)合ERL治療胰腺癌可能的生物分子機(jī)制，為臨床用藥及新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株、主要藥品和試劑 人胰腺癌細(xì)胞PANC-1由中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供，GEM、ERL購自美國Selleck Chemicals公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、含0.02%EDTA的0.25%胰酶溶液購自美國GIBCO公司，胎牛血清購自以色列Biological Industries公司，SDS、TEMED、Tris-Base、甘油、甘氨酸、Tween-20、RIPA、PMSF蛋白酶抑制劑均購自北京索萊寶公司，兔抗人抗體p53蛋白、BAX抗體購自武漢三鷹公司，二抗(羊抗兔)購自艾菲公司，一抗稀釋液購自碧云天公司，ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司，Marker購自美國Therom公司，PVDF蛋白雜交膜購自美國Millipore公司，Annexin-V APC/7AAD流式凋亡試劑盒購自中國聯(lián)科公司，TRIzol購自美國BD公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇購自上海生工生物工程有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時熒光PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。p53、GAPDH引物購自南京金斯瑞生物技術(shù)公司(p53:上游引物：CAGCACATGACGGAGGTTGT，下游引物：TCATCCAAATA CTCCACACGC；GAPDH上游引物：ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG，下游引物：GCCATCACGCCACAGTTTC)。

1.1.2主要儀器 Optima XPN-80超高速離心機(jī)購自美國BECKMAN公司，371型細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，AB2-4S1型生物安全柜購自新加坡藝思高科技公司，Mini-Pharma型垂直電泳儀購自美國Bio-Rad公司，3300型成像系統(tǒng)的影像分析器購自中國勤翔公司，CFX96型實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司，NanoDrop 2000核酸定量儀購自美國Thermo公司，Navios三激光10色流式細(xì)胞分析儀購自美國BECKMAN公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)分組 PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)條件是在25 cm2斜頸濾膜透氣培養(yǎng)瓶中加入4～5 mL含10%滅活胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，5%的 37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞呈單層貼壁生長，細(xì)胞生長至80%～90%時用0.25%含EDTA胰酶消化傳代；取生長良好的對數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞分別在無任何藥物完全培養(yǎng)基(對照組)、含12 nmol/L ERL完全培養(yǎng)基(ERL組)、含80 nmol/L GEM完全培養(yǎng)基(GEM組)及含20 nmol/L ERL和4 nmol/L GEM完全培養(yǎng)基(ERL聯(lián)合GEM組)中培養(yǎng)24 h。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將1.3.1項下各組培養(yǎng)24 h后的PANC-1細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌、胰酶消化后，收集1 × 105個細(xì)胞至離心管中。用Annexin V-APC/7AAD細(xì)胞凋亡法處理收集到的細(xì)胞，取500 μL染色緩沖液(Binding Buffer )重懸細(xì)胞，每管加入Annexin V-APC 5 μL和7-AAD 10 μL，室溫避光孵育細(xì)胞5 min，將染好的細(xì)胞放入Navios三激光10色流式細(xì)胞分析儀中檢測凋亡細(xì)胞數(shù)，比較各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.3實(shí)時熒光定量PCR法檢測p53基因表達(dá) 將1.2.1項下各組培養(yǎng)24 h后的PANC-1細(xì)胞用PBS溶液清洗3次，采用Trizol法提取樣品中總RNA，并使用NanoDrop 2000核酸定量儀檢測并鑒定總RNA濃度及純度。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用實(shí)時熒光定量PCR試劑盒檢測p53，反應(yīng)體系按照解鏈(95 ℃、30 s)，退火延伸(95 ℃、5 s，60 ℃、30 s)，共40個循環(huán)。根據(jù)儀器檢測得到的循環(huán)閾值(Cycle threshold，CT值)，通過相對定量2-ΔΔCt法計算得到基因的相對表達(dá)量。

1.2.4Western blot蛋白印跡法檢測p53、BAX蛋白表達(dá) 將“1.2.1”中各組培養(yǎng)24 h后的PANC-1細(xì)胞收集至1.5 mL離心管中，PBS溶液清洗，以2 000 r/min離心10 min后去除廢液，重復(fù)3次。冰上加入含PMSF的RIPA蛋白裂解液200 mL混懸細(xì)胞，冰上裂解30 min后，以4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液并加入5×聚丙烯酰氨凝膠電泳上樣緩沖液(SDS-PAGE Loading Buffer)，金屬浴100 ℃加熱5～10 min，立即放置于冰中保存于-80 ℃冰箱。Western blot 蛋白印跡系樣品在10% 的SDS聚丙烯酰胺凝膠中，80 V恒壓電泳30 min后電壓上調(diào)至120 V，恒壓電泳約60 min；用0.45 μm PVDF膜、250 mA恒流濕轉(zhuǎn)90 min，5%脫脂牛奶室溫封閉30 min后，將PVDF膜放入稀釋好的p53一抗孵育液、BAX一抗孵育液及GAPDH一抗孵育液中，4 ℃恒溫孵育過夜；室溫中孵育二抗60 min后用TBST室溫振蕩洗膜，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液后于化學(xué)發(fā)光儀中曝光并觀察結(jié)果，通過Image J軟件進(jìn)行圖像分析蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PANC-1細(xì)胞凋亡

聯(lián)合組PANC-1細(xì)胞的凋亡率分別高于對照組、GEM組和ERL組細(xì)胞(P<0.05或P<0.01)，但其余各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注：A為對照組，B為ERL組，C為GEM組 ，D為聯(lián)合組，E為各組細(xì)胞凋亡率；與聯(lián)合組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001。

2.2 PANC-1細(xì)胞中p53基因表達(dá)

與對照組比較，GEM組、ERL組和聯(lián)合組PANC-1細(xì)胞中p53基因的表達(dá)量均明顯下降(P<0.001)。見圖2。

注：與對照組比較，(1)P<0.001，(2)P<0.0001。

2.3 PANC-1細(xì)胞中p53蛋白和BAX蛋白表達(dá)

聯(lián)合組PANC-1細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)量分別低于對照組、GEM組和ERL組(P<0.05或P<0.01)，其余各組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合組PANC-1細(xì)胞中BAX蛋白表達(dá)量分別高于對照組、GEM組和ERL組(P<0.05或P<0.01)，其余各組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、圖4。

3 討論

胰腺癌患者死亡率高，生存期短，中位生存期介于4～6月[13]，且大多數(shù)對胃腸道癌癥起效的化療方案對胰腺癌并沒有很好的應(yīng)答[3,14]。目前在胰腺癌的治療中，GEM作為胰腺癌治療的一線用藥廣泛應(yīng)用于臨床中[6]。由于腫瘤的異質(zhì)性，單獨(dú)使用GEM易導(dǎo)致胰腺癌患者產(chǎn)生耐藥性[6,15]。與此同時，多數(shù)GEM的聯(lián)合化療方案雖然在II期研究中發(fā)現(xiàn)很有前景，但在隨后的臨床人群隨機(jī)實(shí)驗(yàn)中并未對患者總體生存期有明確的改善，例如GEM-氟尿嘧啶、GEM-伊立替康、GEM-順鉑和GEM-奧沙利鉑等，即聯(lián)合用藥似乎與單獨(dú)使用GEM的存活時間相同或優(yōu)勢不明顯[15]。因此對于那些已經(jīng)接受了以GEM為基礎(chǔ)的一線治療，但治療后效果不佳或僅取得部分進(jìn)展，同時愿意且能進(jìn)行進(jìn)一步化療的胰腺癌患者，目前沒有更優(yōu)的治療選擇[3,7,14]。

注：與聯(lián)合組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01。

注：與對照組比較， (1)P<0.05,(2)P<0.01。

ERL是首個與GEM聯(lián)用后患者生存期出現(xiàn)優(yōu)勢的分子靶向藥物[9-11]。ERL是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，靶向抑制表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR )。研究表明，大部分的胰腺癌患者中EGFR表達(dá)都有明顯上調(diào)，并且與預(yù)后不良和疾病進(jìn)展相關(guān)[16-17]；阻斷EGFR酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)會降低人胰腺腫瘤異種移植物的生長和轉(zhuǎn)移，并改善GEM的抗癌作用[18-19]；ERL的抗腫瘤性與抑制EGFR的表達(dá)有著密切聯(lián)系[9]。但大部分研究的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變型EGFR在胰腺癌中很罕見[11]；有無突變EGFR患者之間的存活時間沒有顯著差異[11]。由于大多數(shù)胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)患者攜帶有EGFR下游的鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)突變[2, 11]。研究表明KRAS的突變會降低ERL對腫瘤的治療效果[11]。因此很難解釋為什么上游EGFR抑制對PDAC患者有益[15]。研究顯示，KRAS突變與p53突變常共存于胰腺癌中，且兩者之間可能存在著一定的聯(lián)系[20]。p53基因是一種抑癌基因，突變后使p53蛋白分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變形成突變型p53蛋白，突變型p53蛋白分子失去了對細(xì)胞生長、凋亡和DNA 修復(fù)的調(diào)控作用，喪失抗增殖特性，反而產(chǎn)生“功能增益”致癌特性，因此p53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?，從而有助于腫瘤細(xì)胞增殖、存活和轉(zhuǎn)移[21-22]。腫瘤中的突變p53基因是在多種腫瘤譜系中廣泛存在的癌基因，與腫瘤的增殖和生存有著密切的聯(lián)系[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，約75%的胰腺癌中發(fā)現(xiàn)有p53基因突變，p53基因的突變與胰腺癌的分化有著密切關(guān)系[2,8]；突變型p53蛋白的持續(xù)表達(dá)是維持小鼠胰腺癌轉(zhuǎn)移表型的需要[25]。在p53信號通路中下游分子BAX是介導(dǎo)p53信號通路的凋亡作用關(guān)鍵分子，通過BAX的釋放以及BAX寡聚化并插入線粒體外膜不可逆地誘導(dǎo)線粒體外膜透化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26-28]。

本實(shí)驗(yàn)選用KRAS、p53均突變的人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞進(jìn)行研究，通過流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GEM組、ERL組及聯(lián)合組均能在體外有效地促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞PANC-1的凋亡，尤其以聯(lián)合組的凋亡程度最為明顯。這似乎表明GEM與ERL合用可以增加對胰腺癌細(xì)胞的抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與此同時，實(shí)時熒光PCR實(shí)驗(yàn)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p53基因表達(dá)在ERL組、GEM組和聯(lián)合組中均呈明顯下調(diào)，GEM組、ERL組以及聯(lián)合組均可以使p53蛋白的表達(dá)水平降低以及BAX蛋白的表達(dá)水平升高，尤其是在聯(lián)合組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果提示GEM聯(lián)合ERL可能通過抑制了胰腺癌細(xì)胞中的突變型p53的表達(dá)，同時誘導(dǎo)了p53信號通路中下游重要分子BAX的表達(dá)升高，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞生長和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。此外，本研究結(jié)果還顯示，兩種藥物的聯(lián)合使用對人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞凋亡、p53和BAX的表達(dá)影響均明顯優(yōu)于兩種藥物的單獨(dú)使用。GEM和ERL的合用在這些方面的表現(xiàn)優(yōu)于兩種藥物單獨(dú)使用，提示兩種藥物在合用中可以增加彼此對胰腺癌細(xì)胞的抑制作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GEM聯(lián)合ERL可能通過影響p53信號通路，下調(diào)突變型p53，誘導(dǎo)并上調(diào)BAX的表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的凋亡作用。然而，有關(guān)兩種藥物聯(lián)合與p53信號通路之間更準(zhǔn)確的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步確定，還需在其他胰腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證，從而為改善胰腺癌藥物治療作用及胰腺癌患者的愈后提供理論依據(jù)。