許蘭， 王麗琨， 周鑫， 伍國(guó)鋒

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 急診醫(yī)學(xué)科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

顳葉癲癇是最常見(jiàn)的耐藥性癲癇類型，其主要的病理改變是海馬硬化(hippocampal sclerosis, HS)及苔蘚纖維發(fā)芽(mossy fiber sprouting, MFS)。耐藥性癲癇模型是研究癲癇治療過(guò)程中發(fā)生耐藥的機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)的重要工具[1-2]。杏仁核電刺激慢點(diǎn)燃癲癇模型是通過(guò)重復(fù)不變抽搐劑量的電刺激、促進(jìn)模型動(dòng)物癇性活動(dòng)強(qiáng)度逐漸增加、最終出現(xiàn)全身性癲癇，這一動(dòng)物模型對(duì)于研究癲癇發(fā)作時(shí)繼發(fā)全身強(qiáng)直陣攣機(jī)制有重要作用；匹羅卡品癲癇模型則是注射匹羅卡品后迅速誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)的發(fā)生，2周后出現(xiàn)自發(fā)性癲癇的反復(fù)發(fā)作[3]：這2種模型都是公認(rèn)的顳葉癲癇模型，但哪一種模型更能反映出海馬的HS或MFS，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用2種方法制作耐藥性癲癇模型，觀察顳葉HS及MFS的改變，探討哪種模型能夠更好地模擬顳葉耐藥性癲癇患者海馬的病理改變。

1 材料及方法

1.1 主要器材和試劑

DW-2000腦立體定位儀、BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)及BL-420F刺激器 (成都泰盟科技有限公司制造)，苯巴比妥注射液(上海新亞藥業(yè)有限公司)，戊巴比妥鈉及卡馬西平(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)，匹羅卡品(美國(guó)sigma公司)，自凝牙托粉(上海齒科材料廠)，苯妥英鈉粉針劑(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

健康成年雄性清潔級(jí)SD大鼠140只，體質(zhì)量180～220 g、平均(200.5±4.3)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、杏仁核敏感組、匹羅卡品敏感組、杏仁核耐藥組及匹羅卡品耐藥組，正常對(duì)照組不予任何處理，其余4組分別制作杏仁核慢點(diǎn)燃和腹腔注射匹羅卡品癲癇模型，造模完成后，每組有10只大鼠進(jìn)入后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 模型制作及耐藥性模型篩選

1.3.1杏仁核耐藥性癲癇模型的制作 模型制作方法參照本課題組文章[4]，模型制作成功后以苯妥英鈉(phentoin，PHT)及苯巴比妥(pentobarbital，PB)篩選耐藥模型，依據(jù)杏仁核后放電閾值(after discharges threshold, ADT)變化進(jìn)行抗癲癇藥物的療效判斷，應(yīng)用抗癲癇藥物后與用藥前ADT值比較，給藥后ADT值不增加或增加小于20% 的大鼠為耐藥模型大鼠，ADT值增高20%以上納入藥物敏感大鼠，ADT值變化不定的大鼠不納入實(shí)驗(yàn)分組。

1.3.2匹羅卡品耐藥性癲癇模型的制作 選取SD大鼠腹腔注射匹羅卡品30 mg/kg[5]，根據(jù)Racines分級(jí)[6]評(píng)價(jià)癲癇發(fā)作程度，觀察大鼠給藥30 min內(nèi)有無(wú)Racines Ⅳ級(jí)以上癲癇發(fā)作，若無(wú)Ⅳ級(jí)以上發(fā)作則每隔30 min重復(fù)注射10 mg/kg匹羅卡品，直至出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及以上癲癇持續(xù)發(fā)作；SE出現(xiàn)持續(xù)90 min后，用地西泮10 mg/kg終止發(fā)作，將14 d后有自發(fā)性癲癇發(fā)作的大鼠視為造模成功，在其右側(cè)杏仁核植入電極監(jiān)測(cè)腦電圖，植入方法參考文獻(xiàn)[4]。模型制作成功后使用24 h視頻腦電監(jiān)護(hù)系統(tǒng)記錄大鼠癲癇發(fā)作頻率、持續(xù)時(shí)間及發(fā)作級(jí)別。2周后開(kāi)始篩選耐藥模型大鼠，并腹腔注射PB[7]，總量30 mg/kg，2次/d，給藥過(guò)程共持續(xù)2周并記錄癲癇發(fā)作次數(shù)和腦電圖變化，用PB后癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間和發(fā)作頻率減少>50%的為藥物敏感的大鼠，用PB后癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間和發(fā)作頻率減少<50%的為耐PB的癲癇大鼠。對(duì)耐PB的癲癇大鼠，繼續(xù)選用卡馬西平(carbamazepine，CBZ)進(jìn)行耐藥性篩選，CBZ灌胃每次40 mg/kg，3次/d，連續(xù)給藥14 d。判斷方法如PB耐藥，對(duì)PB及CBZ均耐藥則入選耐藥組。

1.4 海馬組織病理形態(tài)學(xué)觀察

1.4.1海馬壞死神經(jīng)元數(shù)量觀察 采用HE染色，灌注后取雙側(cè)大鼠海馬，石蠟包埋及HE染色。400 倍鏡下在大鼠海馬CA3區(qū)選取5個(gè)視野，計(jì)算壞死神經(jīng)元占總細(xì)胞數(shù)的百分比：壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)<10%為(+)，壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù) 11%～25%為(++)，壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù) 26%～50%為(+++)，壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)>50%為(++++)。

1.4.2海馬MFS觀察 采用硫化銀染法(Timm's)，MFS在大鼠海馬齒狀回和CA3區(qū)錐體層及起始層，用于評(píng)分的每張切片均取自大鼠大腦中隔區(qū)。采用大鼠海馬齒狀回及CA3區(qū)MFS半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 模型制作情況

隨機(jī)選擇10只SD大鼠為正常對(duì)照組。70只SD大鼠制作杏仁核耐藥模型，其中53只完成造模過(guò)程，18只未有癲癇發(fā)作，成功點(diǎn)燃35只；進(jìn)行藥物篩選，2只死亡，剩余33只中有12只對(duì)PHT耐藥，繼續(xù)進(jìn)行PB耐藥性篩選，有2只對(duì)PB敏感，最后篩選出耐藥組10只，敏感組18只，因ADT值不穩(wěn)定不能分組5只。最終分別選取杏仁核敏感組和耐藥組各10只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。60只SD大鼠制作匹羅卡品耐藥模型，44只完成造模過(guò)程，其中癲癇發(fā)作29只，植入電極發(fā)生顱內(nèi)感染死亡1只，麻醉過(guò)量死亡2只，共有26只完成藥物篩選，對(duì)PB耐藥有15只，繼續(xù)進(jìn)行CBZ藥物篩選，其中3只對(duì)CBZ敏感，最后篩選出符合耐藥組12只，敏感組14只，分別選取匹羅卡平敏感組和耐藥組各10只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 海馬組織病理學(xué)觀察

2.2.1HE染色觀察海馬壞死神經(jīng)元 正常組大鼠海馬CA3區(qū)無(wú)明顯神經(jīng)元損傷性改變，海馬錐體細(xì)胞呈圓形或橢圓形，色質(zhì)分布均勻，核仁明顯，未見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等形態(tài)學(xué)改變(圖1A)。杏仁核和匹羅卡品敏感組大鼠海馬CA3區(qū)破壞基本相似，見(jiàn)圖1B和D；耐藥組大鼠海馬CA3區(qū)組織結(jié)構(gòu)明顯異常，且匹羅卡品耐藥模型較杏仁核耐藥模型破壞更為嚴(yán)重，見(jiàn)圖1C和E。

2.2.2海馬CA3區(qū)神經(jīng)元壞死情況 正常對(duì)照組的大鼠海馬CA3區(qū)僅可見(jiàn)少量神經(jīng)元壞死，2種癲癇模型的海馬神經(jīng)元壞死明顯加重。2種模型敏感組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元壞死比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；匹羅卡品耐藥組較杏仁核耐藥組神經(jīng)元壞死比例增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2種模型敏感組及耐藥組神經(jīng)元壞死比例均較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，且耐藥組高于敏感組(P<0.05)。見(jiàn)表1。大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元壞死情況采用(+)～(++++)的半定量方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示：杏仁核敏感組海馬壞死神經(jīng)元與匹羅卡品敏感組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.39)；杏仁核耐藥組海馬壞死神經(jīng)元與匹羅卡品耐藥模型比較，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.36)，證明2種模型在海馬神經(jīng)細(xì)胞的壞死程度上無(wú)明顯差異。

表1 各組大鼠海馬CA3區(qū)壞死神經(jīng)元比例

注：(1)與正常對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與敏感組比較，P<0.05。

2.3 海馬CA3區(qū)及齒狀回MFS

正常對(duì)照組均未見(jiàn)MFS。杏仁核敏感組可見(jiàn)海馬齒狀回的淺顆粒層和內(nèi)分子層開(kāi)始出現(xiàn)MFS，齒狀回、門區(qū)有密集濃染的黑色顆粒，偶爾或極少見(jiàn)到有MF穿越齒狀回顆粒細(xì)胞層到齒狀回內(nèi)分子層(圖2A)。匹羅卡品敏感組可見(jiàn)海馬齒狀回的淺顆粒層和內(nèi)分子層出現(xiàn)MF發(fā)芽、并逐漸加重，在齒狀回外分子層形成密度較小、淡染的色帶，齒狀回門區(qū)MF發(fā)芽也逐漸增加，染色密度逐漸加深(圖2B)。杏仁核耐藥組可見(jiàn)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞MF發(fā)芽增加，顆粒細(xì)胞軸突穿越顆粒細(xì)胞層，顆粒細(xì)胞上區(qū)有較多片狀分布的Timm顆粒，內(nèi)分子層可見(jiàn)散在的Timm顆粒，海馬錐體細(xì)胞層內(nèi)有中等程度Timm顆粒(圖2C)。匹羅卡品耐藥組海馬MF發(fā)芽進(jìn)行性增加，海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層可見(jiàn)MF穿越顆粒細(xì)胞層，主要位于齒狀回“V”字形結(jié)構(gòu)的上、下側(cè)顆粒細(xì)胞層，顆粒細(xì)胞上區(qū)可觀察到連續(xù)性的Timm顆粒；齒狀回內(nèi)分子層和CA3區(qū)起始層出現(xiàn)密集的深染顆粒，形成濃密的條帶(圖2D)。匹羅卡品敏感組MFS的程度較杏仁核敏感組加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，匹羅卡品耐藥組MFS的程度較杏仁核耐藥組加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

注：A為正常對(duì)照組，箭頭示神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等未見(jiàn)形態(tài)學(xué)改變；B為杏仁核敏感組，箭頭示錐體細(xì)胞排列疏松、形態(tài)不規(guī)則，胞膜皺縮、胞漿變空，核模糊不清，神經(jīng)細(xì)胞減少，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增多；C為杏仁核耐藥組，箭頭示在B的基礎(chǔ)上出現(xiàn)胞膜皺縮、胞核固縮；D為匹羅卡品敏感組，箭頭示病理改變基本同B；E為匹羅卡品耐藥組可見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)明顯異常，箭頭示在C的基礎(chǔ)上核不規(guī)則，多呈三角形，胞漿變紅，核固縮或消失，呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞明顯變少的改變。

注：A為杏仁核敏感組，B為匹羅卡品敏感組，均未見(jiàn)明顯MFS； C為杏仁核耐藥組，錐體細(xì)胞的上方有2級(jí)MFS(箭頭處)；D為匹羅卡品耐藥組，內(nèi)分子層可見(jiàn)有大量棕黃色的MFS，MFS穿過(guò)錐體細(xì)胞層(箭頭處)，提示有3級(jí)MFS。

表2 杏仁核和匹羅卡品模型敏感組及耐藥組大鼠海馬MFS評(píng)分比較(秩和檢驗(yàn))

注：(1)與杏仁核敏感組比較，P<0.05；(2)與杏仁核耐藥組比較，P<0.05。

3 討論

目前癲癇的治療以藥物為主，大多數(shù)癲癇患者經(jīng)單一或聯(lián)合用藥足療程、足劑量治療后發(fā)作可得到控制，但仍有約30%的患者頻繁發(fā)作，表現(xiàn)為反復(fù)性癲癇發(fā)作[9]。反復(fù)發(fā)作給患者心理、認(rèn)知等方面帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)面影響，同時(shí)也增加了患者病死率[10]。耐藥性癲癇是指每個(gè)月至少4次的頻繁癲癇發(fā)作，經(jīng)2種以上的一線抗癲癇藥物正規(guī)治療2年以上，仍不能有效改善[11]。耐藥性顳葉癲癇是成人最常見(jiàn)的局灶性癲癇綜合征，目前其病因尚不明確[12]。反復(fù)癲癇發(fā)作患者存在海馬進(jìn)行性硬化，齒狀回的苔蘚纖維(mossy fiber，MF)異常出芽，從而產(chǎn)生異位突觸聯(lián)系和回返興奮環(huán)路，引起癲癇的反復(fù)自發(fā)性發(fā)作[13-14]。耐藥性癲癇是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，故選擇一種有效的耐藥性模型對(duì)該研究至關(guān)重要。

杏仁核電刺激慢點(diǎn)燃的耐藥癲癇大鼠是一種有用的耐藥性癲癇模型，但成功率低，耗時(shí)耗力。匹羅卡品癲癇模型簡(jiǎn)單易行，但很多因素影響模型制作的成功率，這些因素包括動(dòng)物死亡或不能誘導(dǎo)出癲癇持續(xù)狀態(tài)[15]。Bethmann K[1]用PB及PHT對(duì)杏仁核點(diǎn)燃模型進(jìn)行耐藥性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)PB耐藥的癲癇大鼠中，80%左右對(duì)PHT也耐藥。PB、PHT或CBZ是作用機(jī)制完全不同的一線抗癲癇藥，PB作用于γ-氨基丁酸受體，激活氯離子通道導(dǎo)致突觸后膜超極化，從而抑制突觸后神經(jīng)元的活動(dòng)；而PHT或CBZ為鈉通道阻滯劑，阻斷鈉離子內(nèi)流從而抑制癲癇病灶內(nèi)神經(jīng)元的激活。臨床上對(duì)PB的患者對(duì)PHT甚至CBZ也耐藥，提示對(duì)第一種抗癲癇藥無(wú)效的患者可能即是耐藥性癲癇，因此選用對(duì)2種作用機(jī)制不同的抗癲癇藥耐藥的大鼠作為耐藥癲癇模型是可靠的。PHT因副作用大目前已經(jīng)逐漸退出臨床使用，所以本研究匹羅卡品癲癇模型篩選用相同機(jī)制的CBZ來(lái)替代PHT。

顳葉癲癇的特征為復(fù)發(fā)性癲癇，癲癇反復(fù)發(fā)作可致神經(jīng)細(xì)胞壞死和MFS，其中MFS可促進(jìn)異常興奮性環(huán)路的形成，最終導(dǎo)致難治性癲癇。MFS是突觸重組的主要形式，廣泛存在于難治性癲癇患者和癲癇動(dòng)物模型的腦組織中[16]。MFS是一種異常的神經(jīng)再生、突觸重構(gòu)的過(guò)程，與難治性癲癇的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)[17]。成年大鼠海馬結(jié)構(gòu)受到損傷后可發(fā)生MFS現(xiàn)象[18]，耐藥性癲癇患者海馬齒狀回區(qū)域存在由MFS造成的異常軸突長(zhǎng)出、突觸重建現(xiàn)象[19]。且顳葉癲癇大鼠隨著每一次癲癇發(fā)作，其發(fā)作活動(dòng)會(huì)呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，同時(shí)伴有更明顯的MFS現(xiàn)象[20]。在本研究中，無(wú)論是電點(diǎn)燃還是化學(xué)點(diǎn)燃耐藥性模型都有相似的病理改變。匹羅卡品耐藥模型神經(jīng)元損壞較杏仁核耐藥模型更加嚴(yán)重，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但兩種模型的海馬CA3區(qū)及齒狀回的MF異常出芽非常明顯，尤以匹羅卡品耐藥癲癇海馬的MFS為甚，與杏仁核模型的MFS相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果與Wu等[21]研究相似，有明顯的神經(jīng)細(xì)胞丟失及MFS，還分離出多種與突觸相關(guān)的蛋白，認(rèn)為MFS與異常興奮網(wǎng)絡(luò)的形成密切相關(guān)。匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇后，很多在癲癇發(fā)作條件下產(chǎn)生的顆粒細(xì)胞異常移位到齒狀回區(qū)域，這些異源性顆粒細(xì)胞具有高度興奮性，從而導(dǎo)致papez環(huán)路興奮性增加，易于導(dǎo)致癲癇發(fā)作[22]。但其功能還存在爭(zhēng)論[23-24]，Koyama等[8]認(rèn)為預(yù)防MFS可能是癲癇治療的新策略，但Heng等[25]認(rèn)為，MFS對(duì)于癲癇的形成并非必要，因?yàn)樗麄冏钄郙FS后并不影響自發(fā)性癲癇的形成及發(fā)作頻率。研究表明，匹羅卡品誘發(fā)癲癇狀態(tài)后1 h足以導(dǎo)致海馬組織MFS[26]。本實(shí)驗(yàn)中終止SE的時(shí)間基本在60～90 min，因此本研究發(fā)現(xiàn)明顯的MFS就不難解釋。

綜上所述,2種模型都是可靠的耐藥性顳葉癲癇模型，2者在海馬神經(jīng)元壞死方面無(wú)明顯差異，匹羅卡品敏感組和耐藥組的MFS發(fā)芽均較杏仁核模型明顯加重，說(shuō)明匹羅卡品模型更能夠模擬出耐藥性癲癇患者的MFS的改變，更利于耐藥性癲癇發(fā)病機(jī)制的研究。