趙文平，賈龍剛，路福平，劉夫鋒

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

人體內(nèi)某些蛋白質(zhì)在特定病理?xiàng)l件下會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集，最終在組織或器官內(nèi)形成不溶性淀粉樣蛋白沉積，進(jìn)而引發(fā)如阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)，帕金森綜合癥和II型糖尿病等疾病[1]。AD是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)生在老年及老年前期。目前，AD嚴(yán)重影響著世界上數(shù)以千萬計(jì)的患者，對(duì)家庭和社會(huì)造成了極大的負(fù)擔(dān)[2]。AD的病因復(fù)雜，其中淀粉樣級(jí)聯(lián)假說是目前AD發(fā)病機(jī)制的主流學(xué)說，即淀粉樣β蛋白(Aβ)在腦內(nèi)的錯(cuò)誤折疊和聚集是AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[3-4]。Aβ是由β-分泌酶和γ-分泌酶依次水解淀粉樣前體蛋白APP產(chǎn)生的多肽片段，一般含有39～43個(gè)氨基酸。大量證據(jù)表明Aβ42的聚集性和神經(jīng)毒性最強(qiáng)，在AD的發(fā)病過程中扮演著更關(guān)鍵的角色[5-10]。有研究報(bào)道指出，患者腦脊液內(nèi)Aβ42的濃度在納摩爾每升水平[11-12]。納摩爾到微摩爾每升的低濃度水平上可溶性Aβ寡聚體對(duì)細(xì)胞軸突和突觸已存在明顯毒性作用[13]，表明Aβ42在較低濃度時(shí)便能在體內(nèi)發(fā)生聚集。因此，篩選Aβ42聚集抑制劑成為開發(fā)抗AD藥物的研究熱點(diǎn)。

開發(fā)快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的Aβ42聚集抑制劑篩選方法，對(duì)于開發(fā)抗聚集藥物至關(guān)重要。硫磺素T(thioflavin T，ThT)熒光染色法是目前鑒定淀粉樣蛋白聚集抑制劑的“黃金方法”[14]，其基本原理是，當(dāng)ThT分子結(jié)合到富含β-折疊的淀粉樣纖維上時(shí)，在特定激發(fā)波長(zhǎng)下會(huì)發(fā)出較強(qiáng)熒光。根據(jù)特定波長(zhǎng)下樣品的熒光強(qiáng)度來判斷淀粉樣蛋白纖維的含量，進(jìn)一步分析受試化合物的聚集抑制效果[8, 15-16]。然而該方法存在工作量大、效率低、假陽性高等缺陷。另外，由于體內(nèi)外生理環(huán)境的巨大差異，體外檢測(cè)獲得的抑制劑分子在體內(nèi)可能難以發(fā)揮有效的聚集抑制作用[17-19]。

前期研究表明，將易于錯(cuò)誤折疊和聚集的蛋白質(zhì)基因插入到報(bào)告蛋白的合適位置，報(bào)告蛋白的活性將依賴于插入蛋白的錯(cuò)誤折疊或聚集狀態(tài)[20]。TEM1-β-內(nèi)酰胺酶(TEM1-β-lactamase, βlac)是一種常用的報(bào)告蛋白，βlac位于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞周質(zhì)中，分為αβ和α兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，這2種結(jié)構(gòu)域相互作用，在表面形成一個(gè)底物結(jié)合裂口[21-23]。研究表明，βlac的196位氨基酸殘基位于αβ和α結(jié)構(gòu)域之間，βlac對(duì)該位置附近發(fā)生的插入或缺失特定片段具有耐受性[21, 23-26]?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，將受試蛋白插入到βlac的196和197殘基之間，構(gòu)建βlac-受試蛋白三聯(lián)體融合體系，可將蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與宿主菌對(duì)抗生素的抗性有效聯(lián)系起來[27]。目前，基于βlac的三聯(lián)體融合體系目前已廣泛應(yīng)用于優(yōu)化蛋白質(zhì)的體內(nèi)折疊和體內(nèi)識(shí)別小分子聚集抑制劑等[20-21, 28-29]。本文將Aβ42多肽插入到βlac的196和197殘基之間，構(gòu)建大腸桿菌體內(nèi)βlac-Aβ42篩選體系(圖1)，并利用已知聚集抑制劑，結(jié)合3種檢測(cè)方法對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證(圖2)。

A-βlac;B-βlac-Aβ42圖1 βlac和βlac-Aβ42融合體系示意圖Fig.1 Schematic diagram of βlac and βlac-Aβ42 fusion systems

圖2 篩選體系構(gòu)建流程圖Fig.2 Flow chart of the construction of the inhibitor screening system

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌JM109、BL21(DE3)，pMD19T(Simple)克隆載體和pET28a表達(dá)載體質(zhì)粒保存于本實(shí)驗(yàn)室；高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶NdeI、EcoR I、XhoI、BamH I，大連寶生物公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京索來寶科技有限公司；姜黃素(curcumin)、EGCG、固綠(fast green),上海源葉生物科技有限公司;其他未注明試劑均為分析純，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler nexus PCR儀,德國(guó)eppendorf公司；ZXGP-B2080隔水恒溫箱、ZHJH-C1106C超凈工作臺(tái),上海智城分析儀器制造有限公司；Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī)、NanoDrop 2000蛋白核酸定量?jī)x,美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；Infinite 200PRO多功能酶標(biāo)儀,奧地利TECAN公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA片段、引物合成，pET28a-βlac、pET28a-βlac-Aβ42表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)βlac蛋白氨基酸序列，密碼子優(yōu)化為偏好大腸桿菌表達(dá)的DNA序列。DNA合成及測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，引物由深圳華大基因公司合成，DNA及引物序列見表1。

βlac DNA序列以pUC57-βlac形式合成，NdeI和EcoR I雙酶切pUC57-βlac質(zhì)粒獲得βlac片段，與具有相同黏性末端的pET28a載體框架于16 ℃連接4 h，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)12 h后，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并提取質(zhì)粒送至金唯智基因公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET28a-βlac。

以Nde I-βlac-F，EcoR I-βlac-R為引物，通過PCR技術(shù)，獲得含有酶切位點(diǎn)NdeI/EcoR I的目的片段βlac。參考上述分子生物學(xué)方法，將βlac與T載體片段連接，構(gòu)建T-βlac。用XhoI和BamH I同時(shí)酶切質(zhì)粒T-βlac和Aβ42基因，以相同方法構(gòu)建T-βlac-Aβ42質(zhì)粒。NdeI和EcoR I酶切質(zhì)粒T-βlac-Aβ42，回收目的片段與含有相同黏性末端的pET28a載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，最終獲得表達(dá)載體pET28a-βlac-Aβ42。

1.3.2 斑點(diǎn)滴定實(shí)驗(yàn)[21, 23]

將pET28a-βlac、pET28a-βlac-Aβ42轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組工程菌BL21-βlac，BL21-βlac-Aβ42。挑取單菌落至5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量轉(zhuǎn)接至5 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6，添加終濃度0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，用無菌LB培養(yǎng)基將BL21-βlac，BL21-βlac-Aβ42菌液調(diào)至OD600=0.7，然后用170 mmol/L NaCl 10倍遞增連續(xù)稀釋。取3 μL稀釋液點(diǎn)滴定至LB固體培養(yǎng)基(卡那霉素50 μg/mL，IPTG 0.5 mmol/L)，其中含有終濃度100 μmol/L小分子藥物以及不同濃度的氨芐青霉素(ampicillin, Amp)。將平板置于37 ℃孵育18 h，觀察各Amp濃度下允許菌體生長(zhǎng)的最大細(xì)胞稀釋度。

表1 βlac、βlac-Aβ42基因序列及PCR反應(yīng)所需引物序列Table 1 Sequence of βlac and βlac-Aβ42, and the primers used in the PCR reaction

1.3.3 平板涂布實(shí)驗(yàn)

融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)方法同1.3.2，37 ℃誘導(dǎo)4 h后，用無菌LB培養(yǎng)基將OD600調(diào)至0.7，并用170 mmol/L NaCl 10倍遞增連續(xù)稀釋，吸取50 μL各稀釋液均勻涂布于含有卡那霉素、IPTG、100 μmol/L小分子藥物和不同濃度Amp的6孔板固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱恒溫孵育18 h。

1.3.4 菌體濃度檢測(cè)

融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)方法同1.3.2，37 ℃誘導(dǎo)4 h后，用無菌LB培養(yǎng)基將OD600調(diào)至0.7。于96孔板中分別加入200 μL的目的菌液，同時(shí)加入卡那霉素(終濃度50 μg/mL)，IPTG (終濃度0.5 mmol/L)，小分子藥物(終濃度100 μmol/L)以及不同濃度的Amp，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，于不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)菌液濃度變化。

葉曉曉睜大了眼睛。一千塊一場(chǎng)，13次，她的學(xué)費(fèi)就夠了??！多一項(xiàng)技能總比輟學(xué)好吧。她想，反正涂當(dāng)是支持的，拍就拍吧。

2 結(jié)果與分析

2.1 BL21-pET28a-βlac、BL21-pET28a-βlac-Aβ42表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)βlac氨基酸序列，對(duì)其基因序列進(jìn)行大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化，獲得完整的βlac DNA序列(表1)。將βlac與pET28a表達(dá)載體框架連接，構(gòu)建pET28a-βlac表達(dá)載體質(zhì)粒(圖3-A)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證。結(jié)果如圖3-C所示，4個(gè)轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物與βlac基因理論大小一致(951 bp)。同時(shí)，采用NdeI和EcoR I雙酶切驗(yàn)證pET28a-βlac是否構(gòu)建成功，結(jié)果如圖3-E (泳道1和泳道2)所示，2個(gè)轉(zhuǎn)化子酶切產(chǎn)物與pET28a和βlac基因理論大小一致(5 369 bp和951 bp)?；驕y(cè)序結(jié)果表明目標(biāo)基因序列未發(fā)生突變，證明pET28a-βlac表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A-pET28a-βlac載體示意圖;B-pET28a-βlac-Aβ42載體示意圖;C-菌落PCR驗(yàn)證pET28a-βlac轉(zhuǎn)化Jm109轉(zhuǎn)化子: M-1 kb marker; 1～4-4個(gè)pET28a-βlac轉(zhuǎn)化Jm109轉(zhuǎn)化子;D-菌落PCR驗(yàn)證pET28a-βlac-Aβ42轉(zhuǎn)化Jm109轉(zhuǎn)化子: M-1 kb marker; 1～2-2個(gè)pET28a-βlac-Aβ42轉(zhuǎn)化Jm109轉(zhuǎn)化子; 3-含有pET28a-βlac的對(duì)照菌；E-雙酶切驗(yàn)證pET28a-βlac和pET28a-βlac-Aβ42轉(zhuǎn)化Jm109轉(zhuǎn)化子: M-1 kb marker; 1～2-2個(gè)pET28a-βlac轉(zhuǎn)化Jm109轉(zhuǎn)化子; 3～5-3個(gè)pET28a-βlac-Aβ42轉(zhuǎn)化Jm109轉(zhuǎn)化子圖3 表達(dá)載體pET28a-βlac/βlac-Aβ42的構(gòu)建和驗(yàn)證Fig.3 Construction and identification of pET28a-βlac/βlac-Aβ42

pET28a-βlac-Aβ42表達(dá)載體如圖3-B所示。菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖3-D所示，其中2個(gè)轉(zhuǎn)化子(泳道1和泳道2) PCR產(chǎn)物大小與βlac-Aβ42基因理論大小一致(1 074 bp)。進(jìn)一步雙酶切驗(yàn)證，可觀察到與理論大小一致的pET28a (5 369 bp)片段和βlac-Aβ42 (1 074 bp)片段，如圖3-E中泳道3、4和5所示。結(jié)合測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果證明表達(dá)載體pET28a-βlac-Aβ42構(gòu)建成功。

2.2 βlac和βlac-Aβ42蛋白的表達(dá)

重組質(zhì)粒pET28a-βlac、pET28a-βlac-Aβ42轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌株并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況，由圖4-A可以看出，與BL21-pET28a空白對(duì)照相比，BL21-βlac和BL21-βlac-Aβ42中均觀察到明顯的蛋白條帶(泳道2、3)，片段大小與βlac和βlac-Aβ42理論值一致(33.5和38.0 kDa)，證明2種融合蛋白成功表達(dá)。

同時(shí)，分別檢測(cè)了IPTG誘導(dǎo)后BL21-βlac和BL21-βlac-Aβ42的菌體濃度，結(jié)果如圖4-B所示，2種重組菌株OD600值分別為1.297 5和0.736 5，表明BL21-βlac-Aβ42生長(zhǎng)狀況較差。造成該現(xiàn)象的原因可能是在βlac-Aβ42融合蛋白表達(dá)過程中，Aβ42的快速聚集導(dǎo)致βlac-Aβ42折疊發(fā)生改變，對(duì)Amp抗性降低，導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡，菌體濃度下降。

A-pET28a-βlac和pET28a-βlac-Aβ42表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析；M-蛋白Marker; 1-BL21-pET28a; 2-BL21-βlac; 3-BL21-βlac-Aβ42；B-BL21-βlac與BL21-βlac-Aβ42誘導(dǎo)結(jié)束后的菌液濃度圖4 βlac和βlac-Aβ42蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of the βlac and βlac-Aβ42

2.3 重組大腸桿菌菌株對(duì)氨芐青霉素耐受性分析

通過斑點(diǎn)滴定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組融合蛋白菌株對(duì)Amp的耐受能力，具體實(shí)驗(yàn)方法見1.3.2。為確定最佳Amp濃度，將Amp質(zhì)量濃度設(shè)置為20，50和100 μg/mL。結(jié)果如圖5-A所示，上述3種Amp濃度下，對(duì)照組BL21-βlac均有菌落生長(zhǎng)，說明βlac蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，使重組菌株BL21-βlac具有Amp抗性。與之相反，BL21-βlac-Aβ42未出現(xiàn)明顯的菌落說明由于Aβ42的聚集阻礙了βlac的2個(gè)結(jié)構(gòu)域的正常結(jié)合，導(dǎo)致重組BL21-βlac-Aβ42對(duì)Amp的敏感性增加，因此在同濃度抗性平板上無法正常生長(zhǎng)。

A-Amp質(zhì)量濃度為20、50、100 μg/mL時(shí)，BL21-βlac和BL21-βlac-Aβ42菌落生長(zhǎng)狀況;B-Amp質(zhì)量濃度為0、5、10、15、25、50 μg/mL時(shí)，BL21-βlac和BL21-βlac-Aβ42菌落生長(zhǎng)狀況;C-抗生素濃度與允許菌體生長(zhǎng)的最大細(xì)胞稀釋倍數(shù)(MCDGROWTH)之間的關(guān)系圖5 不同濃度Amp對(duì)BL21-βlac和BL21-βlac-Aβ42生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of different concentrations of Amp on the growth of BL21-βlac and BL21-βlac-Aβ42

為確定BL21-βlac和BL21-βlac-Aβ42允許菌體生長(zhǎng)的最大Amp濃度。將不同Amp濃度梯度0，5，10，15，25，50 μg/mL來進(jìn)行斑點(diǎn)滴定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5-B所示，BL21-βlac在Amp質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)仍能正常生長(zhǎng)，而BL21-βlac-Aβ42在Amp質(zhì)量濃度為15 μg/mL時(shí)菌落已不再生長(zhǎng)。因此，選擇在低Amp濃度范圍(0～10 μg/mL)內(nèi)，以允許菌體生長(zhǎng)的最大細(xì)胞稀釋倍數(shù)(MCDGrowth)來衡量2種重組菌株的生長(zhǎng)情況(圖5-C)。結(jié)果表明，當(dāng)Amp質(zhì)量濃度低于4 μg/mL時(shí)，2種菌的MCDGROWTH值為29，隨著Amp濃度的繼續(xù)增大，BL21-βlac MCDGROWTH值明顯高于BL21-βlac-Aβ42。

綜上所述，當(dāng)Amp質(zhì)量濃度為15 μg/mL時(shí)，BL21-βlac-Aβ42的菌落不能生長(zhǎng)，質(zhì)量濃度降為10 μg/mL時(shí)，2種重組菌的原液不僅可以正常生長(zhǎng)，且隨著稀釋倍數(shù)的增加呈現(xiàn)明顯的梯度效果(圖6)。

A-BL21-βlac；B-BL21-βlac-Aβ42圖6 0～10 μg/mL下Amp重組菌株的生長(zhǎng)狀況Fig.6 The growth of recombinant strains in the presence of Amp (0～10 μg/mL)

2.4 已知Aβ42聚集抑制劑對(duì)體內(nèi)篩選系統(tǒng)的驗(yàn)證

根據(jù)上文確定的Amp濃度范圍，利用已知Aβ42聚集抑制劑，分別通過斑點(diǎn)滴定實(shí)驗(yàn)、涂布實(shí)驗(yàn)以及檢測(cè)重組菌株OD 3種方法來驗(yàn)證BL21-βlac-Aβ42體內(nèi)聚集抑制劑篩選體系的有效性。

2.4.1 斑點(diǎn)滴定實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

姜黃素是從姜科、天南星科中一些植物根莖中提取的化學(xué)成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，并且是一種典型的Aβ42聚集抑制劑[30-31]。分析姜黃素對(duì)BL21-βlac在不同濃度Amp條件下菌體細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖7-A所示，Amp在質(zhì)量濃度0～10 μg/mL范圍內(nèi)，加藥組與未加藥組BL21-βlac在各稀釋倍數(shù)下均有菌落生長(zhǎng)，且隨稀釋倍數(shù)增加，菌落數(shù)目逐漸減少，表明Amp質(zhì)量濃度在0～10 μg/mL范圍內(nèi)，姜黃素的添加不會(huì)顯著影響菌體的生長(zhǎng)。

分別在加與不加姜黃素的條件下誘導(dǎo)表達(dá)βlac-Aβ42，并進(jìn)行斑點(diǎn)滴定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)和允許菌體生長(zhǎng)的最大細(xì)胞稀釋倍數(shù)。圖7-B結(jié)果顯示，未加藥組BL21-βlac-Aβ42允許菌體生長(zhǎng)的最大稀釋倍數(shù)為26。添加姜黃素后，允許菌體生長(zhǎng)的最大稀釋倍數(shù)變?yōu)?10(圖5)。由此可見，由于姜黃素抑制了Aβ42的聚集，使得βlac的2個(gè)結(jié)構(gòu)域正常結(jié)合，恢復(fù)BL21-βlac-Aβ42菌株對(duì)Amp的抗性。以上結(jié)果表明該體系可應(yīng)用于Aβ42聚集抑制劑的篩選。

圖7 (A)0～10 μg/mL Amp下姜黃素對(duì)BL21-βlac生長(zhǎng)狀況的影響；(B)不同稀釋倍數(shù)BL21-βlac-Aβ42在加與不加100 μmol/L姜黃素條件下菌落生長(zhǎng)狀況Fig.7 (A)Effect of curcumin on the growth of BL21-βlac in the presence of 0-10 μg/mL Amp;(B) The growth of BL21-βlac-Aβ42 in different dilution ratios with or without 100 μmol/L curcumin

2.4.2 BL21-βlac-Aβ42發(fā)酵過程中菌液濃度變化

根據(jù)βlac-Aβ42蛋白表達(dá)過程中宿主菌OD600的變化來驗(yàn)證篩選體系。將初始OD600一致的BL21-βlac-Aβ42菌液添加于96孔板中，并分別加入不同質(zhì)量濃度Amp(0，2，4，6，8，10 μg/mL)和終濃度為100 μmol/L的姜黃素。不加姜黃素菌液為對(duì)照組，觀察各組菌液OD600值隨時(shí)間的變化。結(jié)果如圖8所示，在不同Amp濃度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，加藥組與未加藥組菌液OD600值均逐漸增大。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過5 h后，加藥組OD600值明顯高于未加藥組。綜上所述，當(dāng)添加姜黃素后，Aβ42的聚集受到一定程度的抑制，促使βlac的2個(gè)結(jié)構(gòu)域正常結(jié)合，并發(fā)揮對(duì)Amp的抗性作用，改善重組菌株的生長(zhǎng)狀況。

2.4.3 平板涂布實(shí)驗(yàn)

本研究利用3種已知Aβ42聚集抑制劑(Curcumin、EGCG、Fast Green)，通過菌液涂布實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證BL21-βlac-Aβ42篩選體系。將初始OD600值相同的菌液進(jìn)行相同倍數(shù)的梯度稀釋，取稀釋倍數(shù)為0、10、102、103、104和105的菌液進(jìn)行涂板(Amp質(zhì)量濃度為10 μg/mL)。結(jié)果如圖9-A所示，隨著菌體稀釋倍數(shù)的增加，BL21-βlac、BL21-βlac-Aβ42和添加抑制劑后的BL21-βlac-Aβ42菌落數(shù)目均逐漸減少。當(dāng)稀釋倍數(shù)為102時(shí)，菌落數(shù)目明顯減少，但加藥組菌落數(shù)目多于未加藥組。稀釋倍數(shù)為103時(shí)，BL21-βlac-Aβ42無菌落生長(zhǎng)，添加Curcumin、EGCG和Fast Green后，BL21-βlac-Aβ42依然有菌落生長(zhǎng)，且菌落狀態(tài)正常?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，在104范圍內(nèi)將菌液密集稀釋，取稀釋倍數(shù)為0、23、25、26、27、29、210、104的菌液涂板，并選取Curcumin為代表藥物，結(jié)果如圖9-B所示。添加姜黃素的BL21-βlac-Aβ42菌液允許細(xì)胞生長(zhǎng)的最大細(xì)胞稀釋倍數(shù)為104，明顯高于未加藥組(29)，證明姜黃素抑制了Aβ42的聚集，恢復(fù)BL21-βlac-Aβ42對(duì)Amp的抗性，改善菌體生長(zhǎng)狀態(tài)。上述結(jié)果進(jìn)一步證明該體內(nèi)系統(tǒng)可以用來篩選Aβ42聚集抑制劑。

圖8 BL21-βlac-Aβ42菌體質(zhì)量濃度隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化Fig.8 Concentrations changes of BL21-βlac-Aβ42 along with the induction time

A-姜黃素、EGCG、固綠作用下BL21-βlac-Aβ42菌落生長(zhǎng)狀況;B-密集稀釋后，姜黃素作用下菌落生長(zhǎng)狀況圖9 不同Aβ42聚集抑制劑作用下BL21-βlac-Aβ42生長(zhǎng)狀況Fig.9 The growth of BL21-βlac-Aβ42 in the presence of different Aβ42 inhibitors

3 結(jié)論

本研究基于βlac結(jié)構(gòu)特征及Aβ42聚集特性，成功構(gòu)建了BL21-βlac-Aβ42重組菌株，并將該重組菌株應(yīng)用于體內(nèi)篩選Aβ42聚集抑制劑。利用已知Aβ42聚集抑制劑，通過斑點(diǎn)滴定實(shí)驗(yàn)、涂布平板實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)菌液濃度變化實(shí)驗(yàn)對(duì)該體內(nèi)篩選系統(tǒng)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明添加聚集抑制劑后，BL21-βlac-Aβ42菌體在特定Amp濃度條件下生長(zhǎng)狀況得到改善，允許菌體生長(zhǎng)的最大細(xì)胞稀釋倍數(shù)增大，證明了該體系可以應(yīng)用于大腸桿菌體內(nèi)篩選Aβ42聚集抑制劑。本文構(gòu)建的大腸桿菌體內(nèi)篩選體系拓寬了淀粉樣蛋白聚集抑制劑篩選的思路，提供了抑制劑開發(fā)的新方法。