黃滟添 鐘衛(wèi)一（通訊作者） 梁志海 唐國都

（1.廣西醫(yī)科大學附屬民族醫(yī)院消化內(nèi)科 廣西 南寧 530001；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 廣西 南寧 530021）

急性壞死性胰腺炎（acutenecrotizingpancreatitis，ANP）可出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，其發(fā)病機制與氧化應(yīng)激有關(guān)。Trx-2是存在于細胞線粒體一種氧化還原蛋白，Trx-2在防止線粒體氧化應(yīng)激方面具有重要作用[1，2]。本文通過應(yīng)用外源性褪黑素干預ANP大鼠，觀察脊髓組織Trx-2和Trx-2mRNA的表達及脊髓組織病理、氧化應(yīng)激相關(guān)指標，探討Trx-2在ANP的表達與及褪黑索對脊髓組織保護作用的機制。

1.材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠72只，清潔級，體質(zhì)量200～250g（由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）；左旋精氨基酸（Sigma公司）；褪黑素（Sigma公司）；RNAsimpleTolalRNAKit（Tiangen公司）；RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit（Fermentas公司）；SYBRPremixExTaqTM（TaKaRa公司）.兔抗鼠多抗（北京生物合成及生物技術(shù)公司）

1.2 方法

1.2.1 分組及造模

72只大鼠按隨機表法分成ANP組（A組）、褪黑素組（M組）和對照組（C組），每組24只.模型建立：各組大鼠實驗前禁食12h.自由飲水；A組和M組腹腔注射6%左旋精氨基酸25mL/kg體質(zhì)量3次，誘發(fā)ANP；M組在首次注射左旋精氨基酸前0.5h腹腔注射0.25%褪黑素20mL／kg體質(zhì)量，而A組首次注射左旋精氨基酸前0.5h腹腔注射生理鹽水20mL／kg體質(zhì)量；C組則腹腔注射等容積生理鹽水。末次腹腔注射后6、12、24h按時點處死大鼠.留取動脈血，胰腺和頸段脊髓組織標本.

1.2.2 胰腺和脊髓病理學檢查

胰腺和脊髓組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片及HE染色.光鏡下觀察大鼠胰腺和脊髓病理，胰腺病理參考Kusske等[3]的標準評分.

1.2.3 脊髓組織MDA、MPO和血清MDA的測定

制備脊髓組織勻漿和血清標本，采用微量MDA試劑盒和MPO試劑盒（南京建成生物工程研究所），操作按說明書。

1.2.4 免疫組織化學檢測脊髓組織Trx-2表達

采用Elivison二步法檢測脊髓組織Trx-2表達。兔抗鼠多抗工作濃度1：200；生物素化羊抗兔二抗來自即用型免疫組化Elivisionplus廣譜試劑盒。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知表達Trx-2的乳腺癌組織作為陽性對照。應(yīng)用Leica圖像分析系統(tǒng)進行定量灰度掃描，求出給定面積內(nèi)的灰度值。

1.2.5 RT-PCR檢測脊髓組織Trx-2mRNA的表達

取脊髓組織各約50mg，用RNAsimpleTolalRNAKit提取總RNA，以RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBRPremixExTaqTM熒光實時定量PCR擴增目的片段.據(jù)GenBank中的基因序列自行設(shè)計引物，Trx-2mRNA引物，Sense：5'TGGGCTTCCCTCACCTCTAC3'，Anti-Sense：5'GCTGTTTGGCTACCATCTTC3'，產(chǎn)物長度253bp ；β-actin引物，Sense：5'CCCATCTATGAGGGTTACGC3'，Anti-Sense：5'TTTAATGTCACGCACGATTTC3'，產(chǎn)物長度150bp.反應(yīng)條件為：94℃30s；94℃30s，56℃30s，72℃30s，40個循環(huán)；最后72℃2min最后融解曲線分析從56℃起，每增0.5℃進行讀板，直到94℃.每次擴增設(shè)無cDNA的陰性對照.在I-CyclerIQ型實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）上擴增并分析結(jié)果（樣品的Trx-2mRNA表達值=Trx-2mRNA起始拷貝數(shù)/β-actin起始拷貝數(shù)）.

1.2.6 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSSl6.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 胰腺組織病理分值（表1）

2.2 脊髓組織病理

C組脊髓大體未見明顯異常，光鏡下脊髓神經(jīng)元胞體豐滿，與周圍組織連接緊密，胞膜無皺縮，細胞漿、細胞核染色正常.A組脊髓大體見輕度腫脹，光鏡下部分脊髓神經(jīng)元胞體脹大，細胞均質(zhì)濃染，脊髓組織少數(shù)區(qū)域溶解，形成空白區(qū)，炎細胞侵潤明顯，24時點明顯。M組大體改變同C組，鏡下脊髓組織損傷輕，僅部分神經(jīng)元神經(jīng)元胞體稍脹大，少量炎細胞侵潤。

2.3 大鼠脊髓組織MDA、MPO和血清MDA、Trx-2等各項指標的變化（表1）。

表1 3組大鼠脊髓組織MDA、MPO和血清MDA的變化各項指標的比較（mean±SD）

3.討論

Trx是一個廣泛分布的氧化還原蛋白，通過其活性中心可逆地催化許多氧化還原反應(yīng)，參與氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)，目前發(fā)現(xiàn)的Trx有多種，最為重要的是Trx-1和Trx-2。Trx-1是一種內(nèi)生抗氧化物，在胞質(zhì)通過直接清除活性氧而發(fā)揮抗氧化作用，在胞核通過抑制ikB-α的磷酸化，遏制NF-kB的活化，減少致炎細胞因子的表達，發(fā)揮間接抗炎、抗氧化作用[5]。Ritz等[6]認為，Trx-2可相當于Trx-1，在氧化應(yīng)激條件下，可以作為一個備份系統(tǒng)。最近研究揭示，線粒體在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而Trx-2在參與線粒體介導的凋亡途徑和防止線粒體氧化應(yīng)激方面，比Trx-1更具重要作用[2]。

褪黑素具有較強的抗氧化活性，對氧化應(yīng)激的器官具有保護作用。褪黑素分子能跨越任何形態(tài)的屏障進入任何細胞而不受特定細胞間的分布限制。褪黑素能減輕多種物質(zhì)誘導的多種組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。

本實驗結(jié)果顯示，ANP大鼠胰腺組織的Trx-2mRNA的表達較對照組顯著增高，外源性給予褪黑素干預可胰腺和脊髓組織提高胰腺組織的抗氧化能力，減輕胰腺和脊髓組織的損傷，Trx-2在氧化應(yīng)激條件下，作為一個備份系統(tǒng)，Trx-2mRNA的表達水平因此而降低。