侯松林，蔣先虹，周國(guó)俊，李利發(fā)，張廣軍，周彤

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 胃腸外二科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院肝膽胰腸研究所，四川 南充 637000）

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤內(nèi)少數(shù)具有長(zhǎng)期克隆生長(zhǎng)、自我更新和多向分化能力的特殊腫瘤細(xì)胞亞群，與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)關(guān)系密切[1]。但因?yàn)镃SCs含有量很少、較難獲得且費(fèi)用高昂，所以使得建立CSCs的擴(kuò)增模型更具必要性。有幸的是Cariati等[2]發(fā)現(xiàn)，利用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)出的腫瘤球細(xì)胞具有CSCs樣特點(diǎn)，從而為CSCs的研究提供了廣闊的空間。CSCs的惡性程度與其自我更新、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物特性密切相關(guān)[3-4]，因此抑制其惡性生物學(xué)特性表達(dá)成為了CSCs治療的重要策略之一。自噬（autophagy）是細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的、受基因調(diào)控的代謝過(guò)程，其通過(guò)供能、清除異常細(xì)胞器和蛋白質(zhì)、防止染色體異常，在維持細(xì)胞的自穩(wěn)態(tài)、生長(zhǎng)分化以及對(duì)抗環(huán)境壓力等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。而目前，細(xì)胞自噬在結(jié)直腸癌CSCs上述生物學(xué)特性中可能具有的作用還未曾探索。因此，本實(shí)驗(yàn)用無(wú)血清培養(yǎng)法培養(yǎng)人結(jié)直腸癌腫瘤球細(xì)胞（結(jié)直腸癌腫瘤干樣細(xì)胞），并探索結(jié)直腸癌細(xì)胞及其球細(xì)胞自我更新、增殖、侵襲和遷移能力，以及自噬在上述兩種細(xì)胞中發(fā)生的差異。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和設(shè)備

主要材料和試劑：人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞系購(gòu)于美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC），DMEM/F-12培養(yǎng)基、McCoy's 5a培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基添加因子（B27）和牛血清白蛋白（BSA）均購(gòu)于博士德生物工程有限公司，生長(zhǎng)因子購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司，Gibco胎牛血清購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司，4%多聚甲醛購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，兔抗人LC3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3β，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β）、ATG5（autophagy related gene 5，自噬相關(guān)基因5）、ATG7（autophagy related gene 7，自噬相關(guān)基因7）和羊抗兔二抗均購(gòu)于美國(guó)CST公司，CY3紅色熒光羊抗兔二抗購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司，PCR引物（F/R）LC3B：GAG AGC AGC ATC CAA CCA AA/CTG AGA TTG GTG TGG AGA CG；ATG5：GAA GCT GTT TCG TCC TGT GG/TCT GTT GGC TGT GGG ATG AT；ATG7：TTC TGC AAT GAT GTG GTG GC/CAA GAG AGG TTG GAG GCT CA購(gòu)自上海生物工程有限公司，Western blot試劑盒和結(jié)晶紫染液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司。

主要設(shè)備：BIO-RAD電泳儀及Biorad Transblot SD Semi-Dry Transfer Cell轉(zhuǎn)膜儀均系Bio-Rad中國(guó)公司產(chǎn)品，Vilber FusionSolo4顯影成像系統(tǒng)系北京VILBER公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀購(gòu)自ROCHE公司，免疫熒光激光共聚焦儀購(gòu)自O(shè)LYMPUS科技公司，DMIL Leica顯微鏡購(gòu)于徠卡顯微鏡中國(guó)有限公司，CCL-170B-8 ESCO恒溫箱購(gòu)于藝斯高上海貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HCT116細(xì)胞的培養(yǎng)：HCT116細(xì)胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的McCoy's 5a培養(yǎng)基，放置于CO2恒溫孵箱培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞貼壁70%～80%活性較高時(shí)進(jìn)行消化傳代。HCT116球細(xì)胞的培養(yǎng)：在HCT116細(xì)胞活性狀態(tài)較高時(shí)棄原培養(yǎng)液，更換為不含血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，消化離心、調(diào)整密度，最終以3×104/mL的細(xì)胞密度懸浮培養(yǎng)HCT116細(xì)胞以獲得其球細(xì)胞，隔日添加含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基2 mL，共培養(yǎng)2周。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn)分別取對(duì)數(shù)期的HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞進(jìn)行消化、離心，吹打分散為單細(xì)胞懸浮液，最終均以500個(gè)細(xì)胞/孔的密度分別接種于含血清培養(yǎng)基的6孔板中（每組3個(gè)復(fù)孔）。放置入恒溫孵箱中培養(yǎng)，待形成肉眼可見的細(xì)胞集落時(shí)停止培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.3 成球?qū)嶒?yàn)取對(duì)數(shù)期的HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞進(jìn)行消化、離心，加入含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基并吹打分散為單細(xì)胞懸浮液，最終每孔含有4 mL無(wú)血清培養(yǎng)基和1×103的細(xì)胞數(shù)目（每組3個(gè)復(fù)孔），放置于恒溫孵育箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)每視野下形成的細(xì)胞球。

1.2.4 Transwell細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)取Mateigel膠置于4 ℃冰箱溶解并稀釋至10 mg/mL的濃度，加入稀釋后的膠于Transwell小室的上室內(nèi)震蕩鋪平，恒溫孵箱中3 h凝固成膠（遷移實(shí)驗(yàn)省略此步驟）。分別取對(duì)數(shù)期HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞進(jìn)行消化、離心，吹打分散為單細(xì)胞懸浮液并調(diào)整密度為5×105個(gè)/mL待用，最終Transwell小室上室加入200 μL體積約105個(gè)的HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞，Transwell小室下室加入700 μL含10%胎牛血清的McCoy's 5a培養(yǎng)基（每組3個(gè)復(fù)孔），置于恒溫孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h（遷移實(shí)驗(yàn)24 h）后取出小室清除上層凝膠，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.5 免疫熒光激光共聚焦實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期的HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞消化、離心，吹打均勻調(diào)整細(xì)胞密度，取少量細(xì)胞均勻涂抹于防脫片載玻片上，滴加遇冷的4%多聚甲醛固定，0.2%Triton X-100增加細(xì)胞膜通透性，0.5%BSA液封閉，繼而滴加LC3B一抗4 ℃冰箱過(guò)夜，CY3熒光二抗再次孵育，最后于激光共聚焦顯像系統(tǒng)下拍照。

1.2.6 RT-PCR實(shí)驗(yàn)提取對(duì)數(shù)期的HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞的RNA，進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板加入合成的LC3B、ATG5、ATG7等特異引物置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT算法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)提取對(duì)數(shù)期的HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞的蛋白質(zhì)，利用BCA法進(jìn)行測(cè)定蛋白濃度測(cè)定。采用聚丙烯酰氨凝膠行蛋白電泳，以半干轉(zhuǎn)法行蛋白轉(zhuǎn)膜，再加入LC3B、ATG5、ATG7等兔抗人單克隆抗體和羊抗兔二抗進(jìn)行抗體孵育，最后成像系統(tǒng)曝光顯影。以目的蛋白條帶和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，其中LC3B的蛋白表達(dá)水平由LC3II/LC3I的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad prism 7.0和Image J統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

HCT116細(xì)胞在含血清的普通培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)狀態(tài)表現(xiàn)為分叉且不規(guī)則的貼壁生長(zhǎng)（圖1A），而在含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中，HCT116球細(xì)胞則表現(xiàn)為聚集成球的球團(tuán)樣生長(zhǎng)（圖1B）。

圖1 HCT116細(xì)胞及HCT116球細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)（×200） A：HCT116細(xì)胞；B：HCT116球細(xì)胞Figure 1 Growth status of HCT116 cells and HCT116 sphere cells (×200) A: HCT116 cells; B: HCT116 sphere cells

2.2 HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞的增殖能力

采用平板克隆集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在體外增殖能力，結(jié)果顯示：HCT116球細(xì)胞形成的克隆集落數(shù)目為（154.7±4.63）個(gè)，而HCT116細(xì)胞形成的克隆集落數(shù)目為（41.0±1.53）個(gè)，HCT116球細(xì)胞的克隆形成數(shù)明顯多于HCT116細(xì)胞（t=22.57，P＜0.05）（圖2）。

圖2 HCT116細(xì)胞與HCT116球細(xì)胞的克隆集落形成情況Figure 2 Colony formations of HCT116 cells and HCT116 sphere cells

2.3 HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞的自我更新能力

采用成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)細(xì)胞自我跟新能力，結(jié)果顯示：HCT116球細(xì)胞形成新的細(xì)胞球數(shù)目為（3.2±0.2）個(gè)，HCT116細(xì)胞形成新的細(xì)胞球數(shù)目為（1.4±0.24）個(gè)，HCT116球細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力（t=4.81，P＜0.05）（圖3）。

圖3 HCT116細(xì)胞與HCT116球細(xì)胞新形成細(xì)胞球的情況（×400） A：HCT116細(xì)胞；B：HCT116球細(xì)胞Figure 3 Newly formed spheres from HCT116 cells and HCT116 sphere cells (×400) A: HCT116 cells; B: HCT116 sphere cells

2.4 HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞的侵襲、遷移情況

T r a n s w e l l侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（10.66±2.16）個(gè)、（28.50±0.56）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.05，P＜0.05）；侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（41.17±2.30）個(gè)、（156.5±4.87）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.39，P＜0.05）（圖4）。

圖4 HCT116細(xì)胞與HCT116球細(xì)胞侵襲、遷移的發(fā)生情況（×200）Figure 4 Invasion and migration abilities of HCT116 cells and HCT116 sphere cells (×200)

2.5 自噬相關(guān)基因LC3B的熒光表達(dá)情況

LC3是自噬相關(guān)基因ATG8的哺乳動(dòng)物類似物，可以始終與自噬體膜結(jié)合，是自噬過(guò)程中膜動(dòng)力學(xué)的重要標(biāo)志物，也是目前被確認(rèn)最肯定的自噬體標(biāo)志物[6]，CY3二抗發(fā)出的紅色熒光可顯示目的蛋白LC3B的表達(dá)強(qiáng)弱。本研究結(jié)果顯示，HCT116球細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)度較HCT116細(xì)胞明顯升高（t=3.52，P＜0.05）（圖5）。

圖5 兩種細(xì)胞中LC3的CY3紅色熒光表達(dá)情況（×400） A：HCT116細(xì)胞；B：HCT116球細(xì)胞Figure 5 Expressions of CY3 red fl uorescence in the two types of cells (×400) A: HCT116 cells; B: HCT116 sphere cells

2.6 自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)情況

ATG5、ATG7與LC3B一樣是自噬發(fā)生相關(guān)的重要基因，它們參與了自噬體的形成和延伸等重要過(guò)程，也是自噬發(fā)生良好的標(biāo)志物[7]。RT-PCR結(jié)果顯示，HCT116球細(xì)胞組中自噬相關(guān)基因LC3B、ATG5、ATG7等mRNA的表達(dá)明顯較HCT116細(xì)胞組更高（P＜0.05）（圖6）。

圖6 HCT116球細(xì)胞和HCT116細(xì)胞LC3B、ATG5、ATG7的mRNA表達(dá)情況Figure 6 The mRNA expressions of LC3B, ATG5 and ATG7 in HCT116 cells and HCT116 sphere cells

2.7 自噬相關(guān)基因的蛋白表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示，與HCT116細(xì)胞組相比，HCT116球細(xì)胞組中自噬相關(guān)基因LC3B、A T G 5、A T G 7等的蛋白表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.05）（圖7）。

圖7 HCT116球細(xì)胞和HCT116細(xì)胞中LC3B、ATG5、ATG7的蛋白表達(dá)情況Figure 7 The protein expressions of LC3B, ATG5 and ATG7 in HCT116 cells and HCT116 sphere cells

3 討 論

結(jié)直腸癌作為世界上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、病死率已分別高居世界惡性腫瘤第3位和第2位，并且其不斷上升的發(fā)病趨勢(shì)也給人們的生命健康帶來(lái)了重大風(fēng)險(xiǎn)[8]。目前，結(jié)直腸癌的治療措施主要采用手術(shù)切除或聯(lián)合放化療，但是部分患者的臨床預(yù)后卻不甚理想。近年來(lái)的研究[9-10]表明，結(jié)直腸癌較差的臨床預(yù)后可能與結(jié)直腸癌CSCs的持續(xù)存在有密切關(guān)系，因此，針對(duì)結(jié)直腸癌CSCs的治療策略被認(rèn)為可能是從根本上治愈結(jié)直腸癌的重要方法。

自20世紀(jì)90年代Bonnet等[11]首次從白血病患者的血液中獲取白血病干細(xì)胞以來(lái)，諸如乳腺癌、肝癌、宮頸癌等多種實(shí)性腫瘤組織中的CSCs也被不斷發(fā)現(xiàn)和證實(shí)[12-14]。而Ricci-Vitianil等[15]在2007年首次分離出并證實(shí)了結(jié)直腸癌CSCs的存在后，從而也開啟了對(duì)結(jié)直腸癌CSCs的研究步伐。CSCs擁有特殊的生長(zhǎng)方式，其在含有生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)液中可以懸浮生長(zhǎng)并形成CSCs球團(tuán)，而普通腫瘤細(xì)胞則由于不能貼壁生長(zhǎng)而發(fā)生失巢性凋亡[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的腫瘤球細(xì)胞較普通腫瘤細(xì)胞更加接近CSCs的特性，而且能夠高表達(dá)如CD133、CD44等CSCs特異性表面標(biāo)記物[17-18]，除此之外，多位學(xué)者[19-21]在把無(wú)血清培養(yǎng)法與流式細(xì)胞術(shù)或免疫磁珠篩選法進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，上述3種方法篩選獲得的腫瘤細(xì)胞均可展現(xiàn)出較強(qiáng)的干細(xì)胞特性，從而進(jìn)一步肯定了無(wú)血清培養(yǎng)法富集篩選CSCs的價(jià)值[22-23]。

由于CSCs具備較強(qiáng)的惡性生物學(xué)特點(diǎn)，如更強(qiáng)的致瘤能力、更高的侵襲和遷移能力，其惡性程度影響著治療效果[1,24]，因此，探索影響CSCs惡性生物學(xué)特性的潛在機(jī)制具有重要意義。自噬本質(zhì)上是一種細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的各組分循環(huán)利用，與正常組織相比，實(shí)體腫瘤處于缺氧、高乳酸、細(xì)胞外低pH值和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)高消耗的微環(huán)境下，而自噬則可通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)代謝活性和物質(zhì)利用效率進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)外部微環(huán)境的壓力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷的研究發(fā)現(xiàn)[25-26]，自噬參與了對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡和藥物抵抗的調(diào)節(jié)，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。在此基礎(chǔ)上，部分學(xué)者探索了自噬與CSCs的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)自噬可能以某種機(jī)制同樣地參與了對(duì)干細(xì)胞增殖、分化、干性表達(dá)及凋亡發(fā)生的調(diào)控過(guò)程，并影響CSCs對(duì)放化療藥物的敏感性從而致使抗癌治療失敗[27-29]。同時(shí)，Zhai等[30]在動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在擾亂結(jié)直腸癌CSCs中自噬的表達(dá)后，裸鼠形成的種植性腫瘤體積更小，并且更不易形成肝肺的轉(zhuǎn)移性腫瘤，說(shuō)明了自噬可能具有促進(jìn)結(jié)直腸癌CSCs的增殖和轉(zhuǎn)移的作用。然而令人遺憾的是，目前從細(xì)胞生物學(xué)角度對(duì)CSCs和自噬的關(guān)系研究還相對(duì)不足，而對(duì)于自噬與結(jié)直腸癌CSCs生物學(xué)行為的關(guān)系研究更是缺乏。故本次實(shí)驗(yàn)以結(jié)直腸癌腫瘤球細(xì)胞為基礎(chǔ)，從細(xì)胞學(xué)角度進(jìn)一步探索自噬與結(jié)直腸癌CSCs惡性生物學(xué)行為的關(guān)系。

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)和克隆集落形成實(shí)驗(yàn)，比較了HCT116細(xì)胞和HCT116球細(xì)胞自我更新和體外增殖能力，采用Tranwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)比較了它們發(fā)生侵襲和遷移的能力，結(jié)果顯示：⑴ HCT116球細(xì)胞形成新細(xì)胞球的數(shù)目較HCT116細(xì)胞明顯增多，表明HCT116球細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力；⑵ HCT116球細(xì)胞形成的細(xì)胞集落數(shù)目明顯高于HCT116細(xì)胞，表明HCT116球細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外增殖能力；⑶ HCT116球細(xì)胞較HCT116細(xì)胞穿透基底膜侵襲到小室下層或直接遷移到下層的細(xì)胞數(shù)目顯著增多，提示HCT116球細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和遷移能力。上述的結(jié)果不同程度的表明了HCT116球細(xì)胞具有更強(qiáng)的惡性生物學(xué)行為能力。同時(shí)，通過(guò)Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出在HCT116球細(xì)胞中自噬特異標(biāo)記基因LC3B、自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7均呈現(xiàn)顯著的高表達(dá)，而HCT116球細(xì)胞中LC3B也具有較高的熒光表達(dá)強(qiáng)度，上述結(jié)果均顯示出HCT116球細(xì)胞中自噬的表達(dá)具有更高的活性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞自噬在具有更高惡性生物學(xué)行為能力的HCT116球細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于HCT116細(xì)胞，提示出較高的自噬活性可能與人結(jié)直腸癌HCT116球細(xì)胞較高的自我更新、致瘤、侵襲和遷移能力有關(guān)，抑制自噬可能具有降低結(jié)直腸癌CSCs生物學(xué)惡性程度的作用，自噬或許能夠成為未來(lái)針對(duì)結(jié)直腸癌CSCs治療的重要靶點(diǎn)。