劉蒙，黃曉東，韓崢，朱慶曦，譚潔，劉維潔，陳巍，鄒艷麗，田霞

（武漢大學(xué)同仁醫(yī)院/武漢市第三醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖北 武漢 430061）

結(jié)腸癌是一種世界范圍內(nèi)具有高發(fā)病率、高致死率的惡性腫瘤[1-2]，且其發(fā)病率呈現(xiàn)迅速增長(zhǎng)趨勢(shì)[3-4]。常見(jiàn)的治療方法有手術(shù)、放療和化療，對(duì)于非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，手術(shù)切除治療是最有效的治療方法。但對(duì)于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，手術(shù)后存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，而術(shù)后輔助化療可以降低這些風(fēng)險(xiǎn)。5-氟尿嘧啶（5-FU）是結(jié)腸癌治療中最常用的輔助化療藥物之一，其可通過(guò)阻斷胸腺嘧啶的合成從而影響DNA的合成，并可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡[5-6]。但5-FU對(duì)正常細(xì)胞具有毒性作用，而癌細(xì)胞也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，這是結(jié)腸癌治療失敗的主要原因[7]。因此，研究細(xì)胞對(duì)5-FU產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制，有助于提高結(jié)腸癌術(shù)后輔助化療的成功率，從而提高患者的生存率。建立耐藥細(xì)胞株對(duì)于腫瘤耐藥性機(jī)制的研究是十分必要的，本研究利用大劑量5-FU反復(fù)接觸結(jié)合藥物濃度遞增法誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、LoVo和SW480，從而建立結(jié)腸癌耐藥株HT-29/5-FU、LoVo/5-FU和SW480/5-FU，并對(duì)原代細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，初步探討結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

兔抗P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）多克隆抗體、兔抗多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）多克隆抗體、兔抗ATP結(jié)合盒超家族G成員2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）單克隆抗體、兔抗第十號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）多克隆抗體、兔抗蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）多克隆抗體、兔抗p-Akt單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam；PVDF轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Millipore；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、PBS、PBST、MTT購(gòu)自武漢Bioswamp；兔抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST；AKT活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abnova。

1.2 方法

1.2.1 建立耐藥細(xì)胞株采用高濃度5-FU反復(fù)接觸結(jié)合藥物濃度遞增法誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞建立耐藥細(xì)胞株。取生長(zhǎng)狀況良好的HT-29、LoVo和SW480細(xì)胞，先用含10 μg/mL 5-FU的RPMI1640完全培養(yǎng)液在37 ℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始死亡時(shí)，用PBS清洗2次后置于不含5-FU的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后進(jìn)行傳代處理，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)再加入5-FU反復(fù)誘導(dǎo)。將藥物濃度每次增加10 μg/mL，歷時(shí)10個(gè)月獲得在含40 μg/mL 5-FU的RPMI1640完全培養(yǎng)液正常生長(zhǎng)的HT-29/5-FU、LoVo/5-FU和SW480/5-FU耐藥細(xì)胞株。撤藥兩周后，可用于各耐藥細(xì)胞株的生物學(xué)特性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下，觀察結(jié)腸癌親本株HT-29、LoVo和SW480和耐藥株HT-29/5-FU、LoVo/5-FU和SW480/5-FU的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 MTT檢測(cè)藥物敏感性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合貼壁后，分別加入藥物濃度為0、5、10、20、40、100 μg/mL 5-FU繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72 h，取出3個(gè)復(fù)孔，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)3 h后棄孔內(nèi)液體，加入150 μL二甲基亞砜，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各藥物濃度處理組的OD490值。計(jì)算各時(shí)間段、各藥物濃度處理的細(xì)胞抑制率，分析細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）和耐藥指數(shù)（resistant index，RI）。

1.2.4 流式檢測(cè)細(xì)胞周期取0、10、40 μg/mL 5-FU處理下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的親本株和耐藥株，制備成單細(xì)胞懸液后收集1×106個(gè)細(xì)胞，棄上清，PBS清洗兩次后重懸細(xì)胞。-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞過(guò)夜。PBS清洗后，加入400 μL PI（50 μg/mL）和 10 μL RNase A（10 mg/mL）混勻后，37 ℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀根據(jù)細(xì)胞DNA含量不同對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，分析細(xì)胞周期情況。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平取生長(zhǎng)狀況良好的親本細(xì)胞和經(jīng)過(guò)不同濃度5-FU（10、40 μg/mL）處理后的耐藥細(xì)胞，根據(jù)TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 s，56 ℃退火10s，72 ℃延伸30 s。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入裂解液，收集細(xì)胞總蛋白。以20 μL上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉。根據(jù)說(shuō)明書(shū)稀釋一抗（P-gp：1:5 000；MRP1：1:1 000；ABCG2：1:1 000；PTEN：1:1 000；AKT：1:2 000；p-Akt：1:1 000；GAPDH：1:1 000）和二抗（經(jīng)HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG：1:10 000），加入一抗室溫孵育1 h，PBST清洗2次后再加入二抗，室溫孵育1 h。PBST清洗后加入化學(xué)發(fā)光試劑，顯影，讀取條帶灰度值。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.7 Akt活性檢測(cè)根據(jù)Akt活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各組結(jié)腸癌細(xì)胞的Akt活性水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

耐藥株細(xì)胞形態(tài)與親本株相比發(fā)生了較大的變化，親本細(xì)胞（HT-29、LoVo、SW480）一般為圓形或梭形，細(xì)胞體積較小，緊密貼壁生長(zhǎng)。耐藥株（HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU）多為不規(guī)則形狀，且部分細(xì)胞具有偽足，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞間隙較大，分布較松散，細(xì)胞內(nèi)顆粒增加（圖1）。

圖1 親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞形態(tài)觀察（×200）Figure 1 Morphological observation of the parental cells and drug-resistant cells (×200)

2.2 藥物敏感性檢測(cè)

隨著5-F U藥物濃度的升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，親本株細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸升高。耐藥株細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率也隨著5-F U濃度的升高而增長(zhǎng)，但最終趨于穩(wěn)定，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率變化幅度不大。與親本株相比，耐藥株在各時(shí)間段、5-FU各濃度處理下的抑制率都低于親本株（圖2）。HT-29/5-FU細(xì)胞IC50為（1 051.000±22.76）μg/mL，HT-29細(xì)胞IC50為（145.713±12.39）μg/mL，RI=7.213；LoVo/5-FU細(xì)胞IC50為（689.995±17.77）μg/mL，LoVo細(xì)胞IC50為（117.969±10.14）μg/mL，RI=5.849；SW480/5-FU細(xì)胞IC50為（1 176.977±19.48）μg/mL，SW480細(xì)胞IC50為（73.84±6.33）μg/mL，RI=15.940。比較親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的IC50，耐藥細(xì)胞的IC50明顯高于親本細(xì)胞（均P＜0.01）。

2.3 細(xì)胞周期分析

經(jīng)過(guò)不同濃度的5-FU（0、10、40 μg/mL）處理后的親本細(xì)胞（HT-29、LoVo、SW480）和耐藥細(xì)胞（HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU）隨著5-FU濃度的升高，處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量明顯增加（均P＜0.05），表明5-FU可以使結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期。與親本細(xì)胞相比較，同一濃度5-FU（不包含0 μg/mL）處理下的耐藥細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（均P＜0.05）（圖3）。

2.4 RT-PCR檢測(cè)耐藥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

與親本細(xì)胞HT-29、LoVo、SW480相比較，經(jīng)過(guò)10、40 μg/mL的5-FU處理過(guò)的耐藥細(xì)胞的耐藥相關(guān)基因P-gp、MRP1、ABCG2、Akt的mRNA的表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），PTEN的mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與10 μg/mL 5-FU處理過(guò)的耐藥細(xì)胞HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU相比，40 μg/mL 5-FU處理過(guò)的耐藥細(xì)胞HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU的P-gp、MRP1、ABCG2、Akt mRNA的表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.01），PTEN的mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）（圖4）。

圖2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線Figure 2 Cell viabilities measured by MTT and growth inhibition curves

圖3 5-FU處理后的親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例 1）與未處理的親本細(xì)胞比較， P＜0.05；2）10 μg/mL 5-FU處理的親本細(xì)胞比較，P＜0.05；3）與40 μg/mL 5-FU處理的親本細(xì)胞比較，P＜0.05；4）與未處理的耐藥細(xì)胞比較，P＜0.05；5）與10 μg/mL 5-FU處理的耐藥細(xì)胞比較，P＜0.05Figure 3 Proportion of cells in G0/G1 phase in parental cells and drug-resistant cells after 5-FU treatment 1) P＜0.05 vs.untreated parental cells; 2) P＜0.05 vs.parental cells treated with 10 μg/mL 5-FU; 3) P＜0.05 vs.parental cells treated with 40 μg/mL 5-FU;4) P＜0.05 vs.untreated drug-resistant cells; 5) P＜0.05 vs.drug-resistant cells treated with 10 μg/mL 5-FU

2.5 Western blot 檢測(cè)耐藥相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平

經(jīng)過(guò)10、40 μg/mL的5-FU處理過(guò)的耐藥細(xì)胞的P-gp、MRP1、ABCG2、p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于親本細(xì)胞（均P＜0.01），PTEN蛋白表達(dá)水平明顯低于親本細(xì)胞（均P＜0.01）。與10 μg/mL 5-FU處理過(guò)的耐藥細(xì)胞HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU比較，40 μg/mL 5-FU處理過(guò)的耐藥細(xì)胞HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU的P-gp、MRP1、ABCG2、p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.01），PTEN蛋白表達(dá)水平明顯降低（均P＜0.01）（圖5）。

圖4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞P-gp、MRP1、ABCG2、AKT、PTEN的mRNA表達(dá) 1）與各自親本細(xì)胞比較，P＜0.01；2）與10 μg/mL 5-FU處理的同一耐藥株比較，P＜0.01Figure 4 The mRNA expression levels of P-gp, MRP1, ABCG2, Akt and PTEN detected by qRT-PCR 1) P＜0.01 vs.corresponding parent cells; 2) P＜0.01 vs.same drug-resistant cell line treated with 10 μg/mL 5-FU

圖5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞P-gp、MRP1、ABCG2、p-Akt、PTEN蛋白表達(dá) 1）與各自親本細(xì)胞比較，P＜0.01；2）與10 μg/mL 5-FU處理的同一耐藥株比較，P＜0.01Figure 5 The protein expressions of P-gp, MRP1, ABCG2, p-Akt and PTEN detected by Western blot 1) P＜0.01 vs.corresponding parent cells; 2) P＜0.01 vs.same drug-resistant cell line treated with 10 μg/mL 5-FU

2.6 Akt活性水平比較

利用A k t活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)A k t活性，p-GSK-3α蛋白表達(dá)量的高低反映了細(xì)胞中Akt的活性水平，結(jié)果顯示，與HT-29、LoVo、SW480相比，10、40 μg/mL 5-FU處理后的HT-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU的p-GSK-3α蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，且呈明顯濃度依賴性（均P＜0.05）（圖6）。

圖6 Akt活性檢測(cè) 1）與各自親本細(xì)胞比較，P＜0.01；2）與10 μg/mL 5-FU處理的同一耐藥株比較，P＜0.01Figure 6 Detection of Akt activities 1) P＜0.01 vs.corresponding parent cells; 2) P＜0.01 vs.same drug-resistant cell line treated with 10 μg/mL 5-FU

3 討 論

對(duì)于不能進(jìn)行手術(shù)切除的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者，若無(wú)其他方法治療，其平均預(yù)期壽命約為8個(gè)月，治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的標(biāo)準(zhǔn)藥物有5-FU、奧沙利鉑和伊立替康等[8]。5-FU單獨(dú)使用或與其他藥物聯(lián)合治療可作為結(jié)腸癌術(shù)后輔助化療形式[9]，5-FU是一種胸腺嘧啶合成酶（thymidylate synthetase，TS）的抑制劑，從而有抑制DNA合成的作用。而且，5-FU對(duì)RNA的合成也有一定的抑制作用[10]。由于5-FU是結(jié)腸癌術(shù)后輔助化療的一種重要藥物，所以研究其耐藥機(jī)制對(duì)于結(jié)腸癌的治療是十分必要的。建立5-FU耐藥細(xì)胞模型是研究耐藥機(jī)制十分必要的一步，邱婷婷等[11]通過(guò)低濃度5-FU劑量遞增法建立了結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HT-29/5-FU，耐藥細(xì)胞較親本細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，S期細(xì)胞增多，G0/G1期細(xì)胞減少。而本次研究通過(guò)高濃度5-FU反復(fù)接觸并結(jié)合藥物濃度遞增的方法建立了3種結(jié)腸癌細(xì)胞（HT-29、LoVo、SW480）的耐藥株，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)耐藥株的耐藥性顯著高于親本株，且減緩了5-FU對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的G0/G1期阻滯作用。

5-FU化療耐藥機(jī)制包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥，原發(fā)性耐藥與胸苷酸合成酶表達(dá)水平升高密切相關(guān)[12]，而獲得性耐藥機(jī)制并不十分明確。有學(xué)者[13]認(rèn)為其可能的耐藥機(jī)制是通過(guò)激活或過(guò)表達(dá)藥物流失通路的相關(guān)蛋白，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，抑制治療效果。而這些蛋白包括多藥耐藥蛋白（MDR1、P-gp、ABCB1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1、ABCC1）、ABCG2，表達(dá)上調(diào)會(huì)抑制藥物對(duì)癌細(xì)胞的毒性作用，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物的存活能力[13-15]。臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)多藥耐藥蛋白在大腸癌組織中高表達(dá)，可能參與了大腸癌多藥耐藥的形成過(guò)程[16]。本研究結(jié)果顯示：P-gp、MRP1和ABCG2在耐藥株中的表達(dá)水平顯著高于親本株，而這些耐藥蛋白的高表達(dá)導(dǎo)致耐藥細(xì)胞的耐藥性高于親本細(xì)胞，而且高濃度的5-FU對(duì)耐藥細(xì)胞的處理促進(jìn)了耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)。

PTEN是一種重要的抑癌基因，大量研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤疾病中，常常出現(xiàn)PTEN的突變和缺失[17-19]。PTEN的蛋白產(chǎn)物是一種特異性磷酸酶，在Akt信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的作用，通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[20-21]。PI3K/AKT信號(hào)通路可減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，通過(guò)靶向調(diào)控PTEN表達(dá)水平，降低PI3K/Akt通路激活，可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡[22-23]。抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可以增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，PI3K的協(xié)同作用可促進(jìn)Akt磷酸化，而p-Akt可作為5-FU療效的標(biāo)志物[24]。研究[25]顯示，下調(diào)PTEN，增加p-Akt水平可誘導(dǎo)藥物敏感結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥特性。在本研究中，結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞中PTEN蛋白低表達(dá)降低了對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制作用，而PI3K/Akt的激活導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥性增強(qiáng)。

綜上所述，本次研究通過(guò)大劑量5-FU反復(fù)接觸結(jié)合藥物濃度遞增的方法成功建立了耐5-FU的結(jié)腸癌細(xì)胞株H-29/5-FU、LoVo/5-FU、SW480/5-FU。并對(duì)親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，推測(cè)PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與了結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥機(jī)制。耐藥株的建立及耐藥機(jī)制的研究將對(duì)今后結(jié)腸癌的臨床治療和耐藥研究提供重要的理論基礎(chǔ)。