祁文露 肖聰 趙艷 李學(xué)穎 楊青松

摘要：以民族藥白雪茶為材料，多糖提取率為檢測(cè)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶法提取多糖的最佳工藝條件，并測(cè)定多糖在體外清除DPPH和亞硝酸鹽能力。結(jié)果表明，在復(fù)合酶為纖維素酶和木瓜蛋白酶（質(zhì)量比1∶4）條件下，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)長(zhǎng)1.0 h，pH 5.0，酶濃度3.0%，白雪茶多糖提取為10.81%。白雪茶多糖對(duì)亞硝酸鹽和DPPH自由基均有一定的清除作用，且表現(xiàn)為劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)白雪茶多糖濃度為2.5 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)98%。多糖濃度為2.0 mg/mL時(shí)，對(duì)亞硝酸鈉的清除率達(dá)19.8%。采用復(fù)合酶法提取白雪茶多糖，可以明顯提高多糖的提取率，且該工藝提取的白雪茶多糖對(duì)DPPH自由基有很好的清除作用。

關(guān)鍵詞：復(fù)合酶法;白雪茶;多糖;提取;正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S571.1;R284.2? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）17-0104-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.028? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Based on single factor experiment， the optimum conditions for the complex enzyme extraction of polysaccharides from the ethnodrug Thamnolia spp. was determined by an orthogonal experiments and analysis of variance taking extraction rate as index. Then the ability of polysaccharides to scavenge DPPH and nitrite was determined in vitro too. The results as follow： the extraction rate of Thamnolia spp. polysaccharides was the highest in the case of complex enzymes of cellulase and papain （mass ratio 1∶4）， the enzymolysis temperature at 50 ℃， the enzymolysis time in 1.0 h， pH value at 5.0， and the enzyme concentration in 3.0%. And in these case， the total sugar yield is 10.8%. The Thamnolia spp. polysaccharide extracted by this condition had a certain scavenging effect on nitrite and DPPH free radicals， and showed a dose-effect relationship. When Thamnolia spp. polysaccharide concentration was 2.5 mg/mL， the DPPH radical scavenging rate was 98%. When the polysaccharide concentration was 2.0 mg/mL， the scavenging rate of sodium nitrite was 19.8%. The results showed that the extraction of polysaccharide from Thamnolia spp. by complex enzyme method can significantly increase the extraction rate of polysaccharides. And the polysaccharides extracted from this technology from Thamnolia spp. had good DPPH free radical scavenging ability.

Key words： complex enzymes method; Thamnolia spp.; polysaccharides; extraction; orthogonal experiment

白雪茶（Thamnolia spp.）又稱地茶、太白茶，為地衣類地茶科地茶屬植物，多生長(zhǎng)在海拔4 000～4 200 m的高原雪線附近的陰濕苔地和巖石上[1]。白雪茶可以清熱解毒、生津止渴、清肝明目，是當(dāng)?shù)厝说奶烊槐＝★嬈泛蛡鹘y(tǒng)藥物。許多中外學(xué)者對(duì)白雪茶的化學(xué)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含有各種多糖、甾體、酚酸、縮酚酸、揮發(fā)性成分等，同時(shí)還富含11種人體必需礦物質(zhì)元素[2]。雖然白雪茶具有幾百年的飲用歷史，但由于地理分布特殊、野生資源數(shù)量少、生長(zhǎng)緩慢等原因，其應(yīng)用還未得到大眾的重視。許多研究表明，各種植物來(lái)源的多糖具有良好而廣泛的生物活性，多糖及其衍生物是生物醫(yī)藥方面的研究開發(fā)熱點(diǎn)之一[3]。林春榕等[4]用水提醇沉法從未經(jīng)復(fù)合酶處理的白雪茶中提取多糖，總糖得率為2.609%。該研究還表明白雪茶多糖具有促進(jìn)免疫功能和清除自由基（OH和O2-）的作用。生物酶法作為提取生物活性成分的新技術(shù)已十分成熟，并廣泛應(yīng)用于多糖加工行業(yè)[5-7]，但目前尚未見將生物酶法應(yīng)用于白雪茶的提取和制備中。本研究利用單因素試驗(yàn)和設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化白雪茶多糖的復(fù)合酶法提取工藝，并測(cè)定其在體外清除亞硝酸鹽和DPPH自由基的能力，為后期研究白雪茶多糖相關(guān)藥理作用提供依據(jù)。

2.2? 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，復(fù)合酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)白雪茶多糖提取率影響較大，另外兩個(gè)因素影響較小。根據(jù)k值分析，復(fù)合酶法白雪茶多糖的最佳提取工藝組合為復(fù)合酶濃度3.0%，酶解時(shí)間1.0 h，酶解溫度50 ℃，復(fù)合酶比例1∶4，酶解pH 5.0。

按照上述優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得白雪茶多糖提取率為10.81%（RSD=1.14%）。

2.3? 體外生物活性試驗(yàn)

由圖6可知，白雪茶多糖對(duì)DPPH自由基有較好的清除作用，并且隨著多糖濃度的提高，清除率也提高，多糖濃度在0.5～1.5 mg/mL時(shí)，白雪茶多糖對(duì)DPPH自由基的清除率隨著多糖濃度提高，清除率增加較快。多糖濃度提高到2.5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到98%，表明白雪茶多糖對(duì)DPPH自由基有很好的清除能力。白雪茶多糖和抗壞血酸都對(duì)亞硝酸鈉也有一定的清除作用，白雪茶多糖濃度為2.0 mg/mL時(shí)，達(dá)到最大清除率，為19.8%?？箟难嵩跐舛葹?.5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大值96.7%，雖然白雪茶多糖對(duì)亞硝酸鹽清除能力沒有抗壞血酸強(qiáng)，但也有一定清除作用。

3? 討論

目前，多糖提取的方法有很多種，但傳統(tǒng)提取方法操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)而且提取率相對(duì)較低。相比于超聲波、微波輔助提取法在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的局限性，酶處理法在成本和使用上更加簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備和工藝的要求也較少[10]。酶反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，選擇性強(qiáng)。由于組織中的一些雜質(zhì)類成分如蛋白質(zhì)、果膠等影響提取液的質(zhì)量，通過(guò)添加適當(dāng)?shù)拿福?jīng)過(guò)溫和的酶解反應(yīng)可將液體中雜質(zhì)除去，使體系的澄清度增加。另外，酶解法的溫度和pH不但影響酶的穩(wěn)定性，還影響酶活性中心必需基團(tuán)的解離狀態(tài)和底物的解離狀態(tài)[11]。因此，在最適pH和溫度范圍內(nèi)，底物才能與酶成分結(jié)合，產(chǎn)生大量的產(chǎn)物。將溫度和pH設(shè)計(jì)到最佳條件，改變了以往提取時(shí)資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，對(duì)白雪茶資源的開發(fā)和利用具有重要的意義。

試驗(yàn)首次采用復(fù)合酶輔法提取白雪茶多糖，使白雪茶多糖提取率得到了大幅度提高，提取率為10.81%。與金刷把多糖提取率4.42%[12]、紅雪茶多糖提取率8.91%[13]、玄參多糖提取率8.98%[14]等相比，白雪茶多糖提取率較高，但不及金銀花多糖提取率12.36%[15]和南瓜多糖提取率20.13%[16]，原因可能是由于金銀花和南瓜的總糖含量較高。比較之前林春榕等[4]使用水提法提取白雪茶多糖，本試驗(yàn)的提取率較高?？赡苁菑?fù)合酶中纖維素酶能快速分解細(xì)胞壁的纖維素，從而破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，加快多糖溶出的速率[7]，木瓜蛋白酶使糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)水解，降低它們之間的結(jié)合，利于多糖的浸出。其次利用正交試驗(yàn)確定了白雪茶多糖的最佳提取條件，縮短了提取時(shí)間。但要大規(guī)模應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)開發(fā)與加工，還需考慮與其他提取方法聯(lián)用再進(jìn)一步優(yōu)化提取率。

隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，自由基已成為人們研究的熱點(diǎn)，人體內(nèi)過(guò)多的自由基會(huì)引起酶、氨基酸、蛋白質(zhì)等氧化破壞，對(duì)內(nèi)臟器官、免疫系統(tǒng)的形態(tài)動(dòng)能產(chǎn)生影響，從而引起機(jī)體疾病，甚至死亡[17]。試驗(yàn)測(cè)定了白雪茶多糖對(duì)DPPH自由基和模擬胃液（pH=3）條件下對(duì)亞硝酸鹽的清除能力，結(jié)果表明，白雪茶多糖對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，在白雪茶多糖濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到98%，但對(duì)亞硝酸鹽的清除能力不及同濃度抗壞血酸，清除能力較弱，最大清除能力只達(dá)到19.8%。與其他三種地衣（金刷把、黑石耳和紅石耳）的粗多糖相比較，白雪茶多糖清除DPPH自由基的能力比較弱[18]，下一步對(duì)白雪茶多糖的研究可以考慮從其他方面入手，例如抗腫瘤活性和抗炎活性等。

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