楊 尹， 梁偉偉， 王小華*，沈愛國*， 胡繼明

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點實驗室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

1 前言

快速準(zhǔn)確檢測水源和食物中的病原體微生物對于食品安全和人們健康至關(guān)重要[1]。常見的水源和食源性病原體微生物包括大腸桿菌、嗜肺性軍團(tuán)病桿菌、沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌等等。這些細(xì)菌可以誘發(fā)產(chǎn)生很多嚴(yán)重甚至致命性的疾病，而對這些細(xì)菌的快速和靈敏的檢測可以預(yù)防和控制這些相關(guān)疾病。上世紀(jì)建立的檢測病原體微生物的平板計數(shù)法固然可靠，但它依賴于多重培養(yǎng)與富集并且非常耗時[2]。除此之外的其他方法，如流式細(xì)胞計數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附測定和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等，在靈敏度、特異性等方面均存在一定的局限性，且檢測用時較長、成本偏高[3 - 5]。所以急需開發(fā)一種快速、靈敏、實用、低成本的細(xì)菌檢測方法。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)檢測因其具有無損、高分辨率、耗樣量少、制樣簡單、原位快速準(zhǔn)確等優(yōu)點，為快速檢測細(xì)菌種類提供了一種新的技術(shù)手段。本文基于標(biāo)記和無標(biāo)記兩種方式，對SERS技術(shù)用于細(xì)菌檢測的現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)和介紹。

2 SERS技術(shù)及增強(qiáng)機(jī)理

眾所周知，常規(guī)拉曼光譜的最大不足在于信號強(qiáng)度低及靈敏度不高。1974年Fleishmann等人發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙Ag電極上的吡啶分子的拉曼信號大大增強(qiáng)。1977年Jeanmaire等人對這一現(xiàn)象進(jìn)行了深入研究并總結(jié)了該現(xiàn)象的增強(qiáng)機(jī)理，統(tǒng)稱之為表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)，以此得到的拉曼光譜稱之為表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)[6 - 7]。SERS被發(fā)現(xiàn)后立刻引起了廣泛的關(guān)注，在隨后的幾十年里有大量科研工作者圍繞這個新發(fā)現(xiàn)開展了研究，SERS相關(guān)機(jī)理及應(yīng)用日益深入，尤其是在分子分析、催化監(jiān)控、信號傳感等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

2.1 SERS增強(qiáng)機(jī)理

經(jīng)過四十多年的發(fā)展，SERS的理論研究取得了較大的進(jìn)展。電磁增強(qiáng)機(jī)理在SERS增強(qiáng)機(jī)理研究中占據(jù)主導(dǎo)地位，該機(jī)理認(rèn)為SERS增強(qiáng)主要是由入射光和電場在局域等離子體表面上的耦合作用，且拉曼的增強(qiáng)因子與待測物質(zhì)及材料表面間距離以及接觸面的曲率有關(guān)，而納米材料的形狀、尺寸對電磁增強(qiáng)長程效應(yīng)有決定作用。雖然電磁增強(qiáng)理論在信號增強(qiáng)中起著主要作用，但是仍然無法完全解釋所有的SERS現(xiàn)象，隨后一些學(xué)者們提出化學(xué)增強(qiáng)以做補(bǔ)充。兩種貢獻(xiàn)的SERS機(jī)理見圖1。經(jīng)實驗證實，目標(biāo)分子靠近到等離子體表面后，體系中的各分子能級間會出現(xiàn)電子共振轉(zhuǎn)移，當(dāng)目標(biāo)分子與納米材料表面作用時會引起分子本身電荷的再分布，引起分子極化率的改變，從而增加分子極化率，即拉曼振動增強(qiáng)[8 - 9]。經(jīng)理論計算及實驗證實，納米顆粒粒徑在20～100 nm貴金屬材料的增強(qiáng)因子可達(dá)到104～105，而當(dāng)分子與納米顆粒直接接觸時，增強(qiáng)因子還可以提升1～2個數(shù)量級。但粒徑減小會導(dǎo)致表面等離子體共振(SPR)過小，粒徑過大導(dǎo)致SPR活躍度減弱，這兩種情況均會影響SERS增強(qiáng)因子[10 - 11]。SERS強(qiáng)度可以根據(jù)一個常見的公式[12]來簡要解釋。

圖1 兩種貢獻(xiàn)SERS機(jī)理Fig.1 Two mechanisms contributed to SERS

2.2 SERS增強(qiáng)基底

具有SERS活性的納米粒子對SERS的增強(qiáng)效果有著關(guān)鍵的作用。在過去幾十年中，人們制備了各種種類和形狀的納米粒子，比如納米棒、納米立方體、納米星、納米花生、納米片、納米三角和納米線[13 - 16]。研究者們可以通過合理設(shè)計和控制納米粒子的尺寸、形狀和材料，優(yōu)化SERS增強(qiáng)體系[17 - 18]。Au和Ag是最常見的兩種增強(qiáng)材料。Au納米材料由于其優(yōu)異的生物相容性而經(jīng)常用與細(xì)胞或體內(nèi)研究，Ag納米材料由于其對生命系統(tǒng)有較強(qiáng)毒性，很少用于體內(nèi)分析，但是其優(yōu)異的增強(qiáng)性能有利于體外超靈敏檢測。除此之外，一些半導(dǎo)體材料也有SERS活性，復(fù)合材料由于它們的協(xié)同作用和本身性能可以使SERS基底得到有效改進(jìn)。在單分散納米顆粒的SERS基底中，末端曲率半徑小的納米粒子產(chǎn)生的超強(qiáng)局部電磁場具有非常大的增強(qiáng)因子，當(dāng)納米顆粒相互接觸時將會在它們的接觸區(qū)域產(chǎn)生強(qiáng)烈的局部電磁場增強(qiáng)效應(yīng)，會產(chǎn)生1010以上的增強(qiáng)因子[19]。因此，基于SERS活性基底可以對目標(biāo)分析物進(jìn)行超靈敏檢測。

3 細(xì)菌檢測的SERS方法

基于細(xì)菌檢測的SERS傳感可以分為無標(biāo)記和標(biāo)記SERS方法兩種。每種細(xì)菌都具有內(nèi)源SERS，因此無標(biāo)記SERS方法可以通過直接檢測吸附在活性基底表面細(xì)菌的SERS來對細(xì)菌進(jìn)行鑒別和定量。這種方法獲得的信息直接與細(xì)菌種類有關(guān)，但往往缺乏相應(yīng)的各種細(xì)菌拉曼光譜信息的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，且靈敏度有待進(jìn)一步提高。標(biāo)記SERS方法是采用尖銳的拉曼光譜譜峰和靈敏度高的物質(zhì)作為光學(xué)標(biāo)記，SERS標(biāo)簽上的抗體或適配體與細(xì)菌特異性結(jié)合并構(gòu)建夾心結(jié)構(gòu)，其原理與傳統(tǒng)的熒光染料標(biāo)記和熒光量子點標(biāo)記等非常相似。兩種模式如圖2所示[20]。

圖2 用于細(xì)菌檢測的標(biāo)記(A)和無標(biāo)記SERS法(B)[20]Fig.2 Schematic illustration of label based (A) and label-free based (B) SERS method for bacteria detection[20]

3.1 無標(biāo)記型SERS方法

無標(biāo)記SERS方法通常是在溶液中使納米顆粒的SERS活性基底與細(xì)菌細(xì)胞直接接觸或者結(jié)合，亦或是將細(xì)菌附著在SERS固態(tài)基底上，用可見或近紅外激光激發(fā)，獲得細(xì)菌的SERS譜圖，建立數(shù)據(jù)庫，然后根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分類方法將所獲得的細(xì)菌SERS譜圖進(jìn)行分類鑒定等研究。當(dāng)細(xì)菌與SERS基底接觸時，只有垂直于SERS基底表面的細(xì)菌部分組分的振動模式才會增強(qiáng)，其他的振動模式由于“遠(yuǎn)程效應(yīng)”的影響，增強(qiáng)效應(yīng)并不明顯。此外，增強(qiáng)基底的粒徑與形狀和激發(fā)波長也有較大的影響。所以，不同文獻(xiàn)報道的SERS也不盡相同[21]。

3.1.1 SERS基底(1)SERS固相基底：單分散的Ag球經(jīng)組裝后產(chǎn)生的熱點可以分別鑒別典型的致病微生物大腸桿菌與金黃色葡萄球菌，并且還可以鑒定細(xì)菌是否有生命特征[22]。新穎的的三維納米結(jié)構(gòu)陣列構(gòu)成的SERS增強(qiáng)基底，成功應(yīng)用于臨床及自然環(huán)境中常見七種副溶血性弧菌菌株的檢測鑒定，但它們均未能較好地實現(xiàn)定量檢測。實驗表明，增加細(xì)菌與等離子體顆粒的有效接觸面積可以提高細(xì)菌檢測靈敏度。萬古霉素(Van)是一種常見的抗生素，借助羰基和蛋氨酸的胺基可以與細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖發(fā)生強(qiáng)效鍵合，Van可與肽聚糖形成穩(wěn)定的鍵合作用進(jìn)而拉近細(xì)胞壁部分結(jié)構(gòu)與SERS增強(qiáng)基底之間的距離，從而產(chǎn)生SERS熱點，使本來較微弱的SERS信號增強(qiáng)[23 - 24]。由于修飾有Van的Ag納米材料的基底只與革蘭氏陽性(G+)細(xì)菌具有鍵合作用，所以只能鑒定出G+細(xì)菌[25]，隨后研究發(fā)現(xiàn)修飾有Van的Ag-Au 納米SERS基底對G+和革蘭氏陰性細(xì)菌(G-)都有很好的SERS增強(qiáng)效果[26]。雖然此類借助固態(tài)SERS基底方式可以提供重現(xiàn)性較好的SERS譜圖，但是復(fù)雜的合成過程和高成本限制了其應(yīng)用。

(2)貴金屬溶膠：相比于上述提到的二維或三維SERS基底，貴金屬溶膠制備過程往往更簡便。對于細(xì)菌檢測，無標(biāo)記SERS通常采用單分散的Au納米粒子(AuNPs)或AgNPs或顆粒聚集體，在無機(jī)鹽協(xié)助下簡單地與細(xì)菌細(xì)胞混合[27]。雖然簡單的混合方式使檢測更加簡單、快速，但是所形成的混合物并不總是同質(zhì)的，納米顆粒的分布隨機(jī)性太強(qiáng)，導(dǎo)致所獲得的病原體細(xì)胞表面SERS的重復(fù)性較差，對于細(xì)菌的鑒定或者檢測都不具有代表性。所以基于貴金屬納米顆粒的SERS方法主要是使納米顆粒盡可能多地接觸細(xì)菌表面位點。AgNPs因其優(yōu)越的SERS增強(qiáng)效果已被廣泛用于檢測[28]。常見的結(jié)合方式主要有共培養(yǎng)[29]、靜電結(jié)合[30]、原位還原[31]、靜電和原位的結(jié)合[32]等，見表1。

表1 基于AgNPs的無標(biāo)記SERS探針用于微生物的檢測

由于細(xì)菌細(xì)胞壁上的脂多糖和磷壁酸帶負(fù)電荷從而使細(xì)菌整體顯示負(fù)電性，聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)與AuNPs的逐層結(jié)構(gòu)帶正電，由于靜電吸引，其可以高效地聚集在細(xì)胞壁上，因而實現(xiàn)單細(xì)菌的SERS檢測。但合成這種逐層結(jié)構(gòu)過程比較復(fù)雜，而通過合成帶正電的AgNPs與細(xì)菌直接地靜電結(jié)合可以簡化步驟[33]，但是此方法也沒有進(jìn)行量化實驗。簡而言之，原位還原方法可以在細(xì)菌細(xì)胞壁表面生成納米顆粒，使其比較均勻地遍布在細(xì)菌細(xì)胞壁上。實驗結(jié)果表明，通過靜電作用在細(xì)菌細(xì)胞壁上原位制備的AgNPs可以有效增強(qiáng)細(xì)菌SERS效應(yīng)，從而獲得重復(fù)性比較好的SERS譜圖，此方法可以成功應(yīng)用至飲用水中的細(xì)菌檢測[34]。在對SERS信號的增強(qiáng)能力上，這種原位方法明顯優(yōu)于簡單混合或共培養(yǎng)的方法，其檢出限是2.5×102cell/mL。此外，一種原位還原的方式是借助NaBH4，在采用Triton X-100預(yù)處理的細(xì)菌表面還原產(chǎn)生AgNPs，獲得的細(xì)菌檢測限低于1 000 cell/mL，可實現(xiàn)大腸桿菌(E.coli)，銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和李斯特菌(Listeria)分類及鑒定[35]。另外，實驗發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的SERS強(qiáng)度很大程度上與其表面的Zeta電勢有關(guān)，利用該特征可以將野生型和耐抗生素細(xì)菌進(jìn)行分類鑒別，并且發(fā)現(xiàn)不同活性狀態(tài)下細(xì)菌的電勢也有差異，從而可區(qū)分出活和死細(xì)菌[36]。

(3)多功能的SERS基底：類似過濾結(jié)構(gòu)的金介孔納米材料[37]、爆米花狀磁芯金殼納米顆粒[38]等多功能的SERS探針用于細(xì)菌分離或者濃縮，實現(xiàn)細(xì)菌的SERS高靈敏檢測。修飾有氧化石墨烯(GO)的爆米花結(jié)構(gòu)AuNPs的SERS探針，其SERS具有良好的重復(fù)性，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢出限為10 cell/mL[39]。有些SERS探針兼具較好光熱效應(yīng)，可以殺死耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

3.1.2 影響無標(biāo)記細(xì)菌SERS特征的因素激發(fā)波長和納米材料種類對細(xì)菌的SERS有很大的影響。當(dāng)用激發(fā)波長為514或633 nm的激光照射時，在Ag或Au膠體上所獲得的大腸桿菌、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和核黃素(RF)的SERS是存在差異的[26]。首先對于E.coil，在其細(xì)胞外部利用NaBH4還原AgNO3或HAuCl4生成溶膠顆粒，在514 nm激發(fā)光激發(fā)下，E.coil的SERS譜圖與FAD及其RF都非常相像。其中，F(xiàn)AD和RF在450 nm位置處都有明顯的吸收，持續(xù)到520 nm位置處，在該激發(fā)波長下，無論FAD還是RF都存在預(yù)共振效應(yīng)，SERS信號從而得到增強(qiáng)，可以得出此時E.coil的SERS主要由黃素構(gòu)成，遮蔽了細(xì)胞壁其他組分對光譜的影響。在633 nm激光下，排除黃素預(yù)共振對SERS的影響，發(fā)現(xiàn)除了歸屬到黃素的部分譜峰以外，譜圖中出現(xiàn)了其他位置的峰。AuNPs和E.coil混合之后產(chǎn)生的SERS譜峰大部分來源于其他組分，例如在該激發(fā)光下，735和1 330 cm-1位置的譜峰來源于腺嘌呤的振動。由此可知，不同激發(fā)波長或者不同種類納米材料對細(xì)菌SERS譜圖都有很大的影響，反之，也可以發(fā)現(xiàn)SERS手段在應(yīng)用至細(xì)菌的另一個優(yōu)勢：僅僅更換SERS增強(qiáng)效應(yīng)的納米顆?；蛘{(diào)控激發(fā)波長就能改變細(xì)菌SERS。

細(xì)菌的生長階段也會影響細(xì)菌的SERS。有報道將細(xì)菌置于Ag/AAO底物上[27]，另一篇報道是將細(xì)菌與羥胺還原的AgNPs混合，然后置于CaF2玻片上[40]。這兩項研究的共同點都是利用未修飾的AgNPs作為基底材料，所獲取的SERS主要來源是細(xì)菌組成及其代謝分泌物。利用在600 nm處的吸光值(OD600)對培養(yǎng)基中的E.coil進(jìn)行定量，根據(jù)OD600得到細(xì)菌的生長時間函數(shù)圖，OD600為0.4、1.5、2.0時，分別對應(yīng)細(xì)菌的生長周期的中期、指數(shù)期和穩(wěn)定期狀態(tài)，從這三個不同生長階所獲取的細(xì)菌，經(jīng)離心充分洗滌后，獲得細(xì)菌的掃描電鏡(SEM)圖和SERS譜圖，根據(jù)SEM圖顯示細(xì)菌生長達(dá)到最大時，E.coil看起來有所“縮短”，縱橫比降低，與之對應(yīng)的SERS光譜上也發(fā)生變化，比較明顯的是655、1 130、1 219和1 245 cm-1位置處的強(qiáng)度在指數(shù)階段向穩(wěn)定階段過渡中增加，然而725和1 095 cm-1峰強(qiáng)是呈下降趨勢的。根據(jù)SERS發(fā)生的差異，結(jié)合相對應(yīng)的SEM結(jié)構(gòu)圖中形貌改變，可以初步說明細(xì)菌外側(cè)具有某些高度動態(tài)特性組分或者代謝物質(zhì)。

細(xì)菌受到不同環(huán)境影響會作出響應(yīng)應(yīng)答，選擇性表達(dá)碳水化合物、蛋白質(zhì)或者脂質(zhì)等物質(zhì)。有報道在對E.coil和表皮葡萄球菌的研究中，采用不同的化學(xué)物質(zhì)和壓力條件處理細(xì)菌，包括滅活、饑餓和高溫，所獲得的細(xì)菌SERS與空白組相比差異顯著[38]。一組細(xì)菌在37 ℃條件下培養(yǎng)之后與檸檬酸鹽還原的AgNPs混合；另外兩組樣品在4 ℃和45 ℃分別處理245 min和64 min，之后再以相同條件和AgNPs混合。孵育過夜后，采用陶瓷過濾器過濾上述三組樣品后所獲取的SERS光譜[41]，存在顯著差異，尤其是在1 200至1 700 cm-1區(qū)域，盡管這些結(jié)果只能初步證明，但其仍然有用于直接監(jiān)測細(xì)菌細(xì)胞膜及其代謝過程的潛能。已有研究報道將SERS技術(shù)應(yīng)用至評估細(xì)菌對抗生素的敏感程度[42]。

在這些研究中，采用抗生素氨芐青霉素、苯唑西林、萬古霉素、頭孢噻肟、慶大霉素和四環(huán)素處理E.coil和S.aureus，然后將其放置在Ag/AAO SERS基底上，結(jié)果顯示SERS響應(yīng)主要源于經(jīng)由抗生素處理的細(xì)菌。目前，抗生素干擾細(xì)菌蛋白合成的SERS譜圖變化是很難在短時間被發(fā)現(xiàn)或者捕捉到的，至少在被抗生素治療9～12 h后才被發(fā)現(xiàn)[43]，這是因為即使在沒有新蛋白質(zhì)合成的情況下，依然可以長時間保持細(xì)胞壁的完整性。

3.2 標(biāo)記型SERS方法

由于細(xì)菌SERS信號來源尚無確切定論，同時缺乏標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌SERS譜圖數(shù)據(jù)庫，無標(biāo)記SERS方法在細(xì)菌領(lǐng)域中的研究尚未有較大突破。目前，采用特定的有機(jī)拉曼標(biāo)記分子、目標(biāo)識別分子和等離子體納米顆粒組裝成的SERS標(biāo)記探針，形成放大的特征拉曼信號，用于間接檢測目標(biāo)物質(zhì)。標(biāo)記型SERS探針具備的光學(xué)特性與采用有機(jī)染料和量子點的熒光探針類似，比如有機(jī)染料和量子點，但是標(biāo)記型SERS探針具備其他探針無可比擬的特質(zhì)：拉曼光譜的譜峰寬度僅為1 nm左右，拉曼光譜可以實現(xiàn)多組分在線同時檢測；SERS探針?biāo)峁┑某哽`敏度可用于生物樣品的痕量分析；同時，SERS探針具有很強(qiáng)的光穩(wěn)定性，可有效地避免光漂白和信號淬滅現(xiàn)象；拉曼位移不受激發(fā)光的頻率影響，因此可以通過選擇近紅外光源來避免生物體系中自發(fā)熒光干擾。

圖3 典型的用于細(xì)菌檢測的SERS探針Fig.3 Typical SERS tags for bacteria detection

在典型的SERS探針設(shè)計中(圖3)，拉曼信號分子和識別分子直接修飾到納米顆粒上從而提供增強(qiáng)的拉曼信號[44]。在SERS基底上修飾識別分子，如特異性抗體和適配體的作用為兩方面：一方面賦予SERS探針合適的生物相容性；另一方面賦予SERS探針靶向功能。但是貴金屬納米顆粒在生物體系中不穩(wěn)定，受到多種因素干擾，導(dǎo)致SERS信號輸出受到影響[45]。所以通常會修飾多種表面保護(hù)劑到修飾有拉曼信號分子和識別分子的貴金屬納米顆粒表面，以提高納米粒子的穩(wěn)定性。目前所使用的保護(hù)劑包括多聚物[46]、脂類物質(zhì)[47]、硅層[48]等物質(zhì)。因此，通常用于制備檢測細(xì)菌的SERS探針需要多項修飾過程，主要涉及底物合成、信標(biāo)修飾、表面保護(hù)劑負(fù)載及識別部分修飾等過程。

標(biāo)記型的SERS探針對細(xì)菌檢測的核心之一就是使其具備良好特異性。標(biāo)記型的SERS探針的光學(xué)功能主要受以下因素影響：SERS活性底物，被修飾物質(zhì)的組成及其濃度[49]。不同形狀的貴金屬納米粒子、復(fù)合納米粒子及其聚集體[50]可用作SERS活性底物，其SERS信號分子的增強(qiáng)因子增至108～1013數(shù)量級[51]。用于SERS標(biāo)記的細(xì)菌檢測的標(biāo)記分子目前有4-氨基苯硫酚、4-巰基苯甲酸、羅丹明6G、4-巰基吡啶、5,5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸等物質(zhì)[52 - 54]。

3.2.1 抗體為識別分子的標(biāo)記探針基于抗體的細(xì)菌SERS探針如Ag@SiO2NPs，爆米花形狀的金納米材料和金包單壁碳納米管[55]連接單克隆抗體，可以實現(xiàn)沙門氏菌或耐藥沙門氏菌菌株的檢測。此外，這樣的SERS測定方式還可以在15 min內(nèi)使99%的耐藥性的沙門氏菌失活[56]。載有單域特異性抗體的SERS納米聚集體的探針，可用于實現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)菌的超靈敏檢測[57 - 59]。另外一種硅烷化的SERS探針(NAEBs)可以實現(xiàn)對細(xì)菌的超靈敏檢測，因為探針由硅層包裹，并且是AuNPs的聚集體，所以與裸露的Ag或Au相比更加穩(wěn)定和適用，據(jù)報道它可以在1 h內(nèi)實現(xiàn)病原菌細(xì)菌S.aureus單個細(xì)菌水平檢測[60]。在后續(xù)的研究中，為了進(jìn)一步提高SERS探針對沙門氏菌的靶向特異性，Tay等人將探針修飾上來源于P22噬菌體的蛋白質(zhì)，該蛋白可以靶向到沙門氏菌上的多糖物質(zhì)，從而實現(xiàn)對沙門氏菌的特異性識別，進(jìn)而達(dá)到單個沙門氏菌的超靈敏檢測。

3.2.2 適配體為識別分子的標(biāo)記探針基于適配體的細(xì)菌SERS探針可以根據(jù)羅丹明6G(ROX)信號分子的拉曼強(qiáng)度變化，實時監(jiān)測耐甲氧西林的S.aureus和沙門氏菌對光熱活性反應(yīng)[61]?；谛揎椨羞m配體的AuNPs的SERS生物傳感[62]，可以實現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌和S.aureus的檢測，其中S.aureus的檢出限為35 cell/mL，鼠傷寒沙門氏菌的檢出限為15 cell/mL。另外，有學(xué)者報道了Au@AgNPs-適配體1-目標(biāo)物-適配體2-ROX的SERS傳感，對鼠傷寒沙門氏菌的檢測線性范圍為1.0×101到1.0×105cell/mL，檢出限為15 cell/mL[63]。相比抗體，適配體尺寸更小，合成和標(biāo)記技術(shù)手段比較便宜、簡單，無需免疫原性[64 - 65]，所以適配體在SERS生物分析中更具有優(yōu)勢。

3.2.3 戊二醛為識別分子的標(biāo)記探針基于戊二醛(GA)的細(xì)菌SERS方法也有很多報道。GA是一種小分子物質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖具有很強(qiáng)的交聯(lián)特性。研究者制備出了一種新型的修飾有戊二醛的納米金-三(2,2′-聯(lián)吡啶基)氯化釕-氧化石墨烯多功能化的SERS探針，該探針可以捕獲并檢測S.aureus和E.coil，片狀結(jié)構(gòu)的GO和GA的特性可以實現(xiàn)細(xì)菌的有效捕捉與交聯(lián)，既可以實現(xiàn)超靈敏的mapping成像，又可以借助光熱效果使細(xì)菌失活[66]。另外，借助磁性納米顆粒(MNPs)可以使SERS探針更有效地分離、捕獲細(xì)菌[67 - 69]，即使在復(fù)雜體系中也可以實現(xiàn)多種細(xì)菌的低濃度檢測[70]。

4 總結(jié)與展望

許多研究已表明SERS是一個強(qiáng)大的在線檢測病原菌的常規(guī)技術(shù)，通過合理構(gòu)建標(biāo)記和無標(biāo)記SERS系統(tǒng)，可開發(fā)出新穎和可靠的病原菌檢測方法。盡管SERS技術(shù)得到了很好的發(fā)展，但實現(xiàn)真正量化分析仍然非常具有挑戰(zhàn)性?？梢哉雇ㄟ^提高SERS標(biāo)簽的多重標(biāo)記能力和生物相容性，探索高靈敏和高穩(wěn)定性SERS基底的制備，以及建立基于標(biāo)記和無標(biāo)記SERS方法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，將使SERS技術(shù)成為一種細(xì)菌，特別是病原菌檢測的可靠常規(guī)技術(shù)。