張?jiān)婄鳎?許惠鳳， 周鑫悅， 王麗麗， 陳婷婷， 胡 筱， 余麗雙*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122;2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350122;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122)

汞是污染最為普遍、毒性最強(qiáng)的重金屬，對(duì)人體健康造成了極大危害[1]。傳統(tǒng)的Hg2+檢測(cè)方法如電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、原子熒光法、火焰原子吸收光譜法等[2 - 4]已在實(shí)際檢測(cè)中得到很好的應(yīng)用。此外，采用諸如熒光分析[5]、電化學(xué)傳感[6]等技術(shù)進(jìn)行Hg2+的快檢方法也得到廣泛報(bào)道，這些方法在一定程度上實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的快速靈敏檢測(cè)。即便如此，繼續(xù)尋找高效快速的分析方法仍然是研究者在Hg2+檢測(cè)中一直努力的方向。

近年來(lái)，金屬納米簇的研究受到人們的廣泛關(guān)注。所謂納米簇，通常指由幾個(gè)到幾十個(gè)原子構(gòu)成的相對(duì)穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)。這種納米簇的尺寸通常小于2 nm，接近于電子的費(fèi)米波長(zhǎng)，這賦予其非常獨(dú)特的理化特性，如離散的能級(jí)和強(qiáng)熒光活性等[7 - 9]。金屬納米簇這些特性使其能夠作為理想化的納米材料用于生物醫(yī)藥及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的研究[9 - 10]。其中，貴金屬簇(Au、Ag、Pd和Pt)具有高的比表面積、豐富的表面原子以及顯著的熒光響應(yīng)等特點(diǎn)，常常作為一類(lèi)新型的熒光探針[8 - 9,11]。相比單一金屬簇，雙金屬合金簇能夠通過(guò)控制原子在金屬簇中的分布以獲得額外的自由度。同時(shí)，合成的合金簇具有更優(yōu)異的光電活性，Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)在Pb簇表面引入Au原子能顯著提高其葡萄糖氧化的活性。另有報(bào)道表明，在Au納米簇(AuNCs)中引入Ag能更有效地增強(qiáng)其熒光[12]，并且這些具有強(qiáng)熒光響應(yīng)的合金簇也能夠用于金屬離子的檢測(cè)。Jin課題組合成了硫醇類(lèi)包覆的AuNCs，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ag+能明顯引起該金簇?zé)晒鈴?qiáng)度的增強(qiáng)，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Ag+檢測(cè)[13]。而采用不同模板合成的Au/AgNCs也能夠?qū)r3+、Cr6+、As3+等重金屬離子進(jìn)行定量檢測(cè)[14 - 15]。

截止目前，已有多種生物分子比如蛋白質(zhì)、多肽和寡核苷酸[16 - 19]等被用作合成金屬納米簇的模板，以增強(qiáng)其光穩(wěn)定性并減小納米簇的聚沉。本研究以牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)為模板合成了具有強(qiáng)熒光響應(yīng)的金銀納米簇(BSA-Au/AgNCs)，并以此為熒光探針來(lái)構(gòu)建檢測(cè)Hg2+的方法。該方法對(duì)Hg2+的響應(yīng)范圍為2～30 nmol/L，檢測(cè)限達(dá)到0.6 nmol/L。同時(shí)，該方法對(duì)Hg2+有良好的特異性，可以對(duì)實(shí)際水樣中汞的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FS5型熒光光譜儀(英國(guó)，Edinburgh公司)；AVATAR360型傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)，Nicolet公司)；TECNAI G2F20型高分辨率透射電子顯微鏡(美國(guó)，F(xiàn)EI公司)；QL-866型振蕩器(江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)；KQ520DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

牛血清白蛋白(BSA)、HAuCl4·3H2O購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；NaOH、Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·12H2O、AgNO3、Hg(NO3)2等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純。水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BSA-Au/AgNCs的合成所有用于合成BSA-Au/AgNCs的玻璃器皿事先都先用王水浸泡4 h，然后用乙醇漂洗，最后用水沖洗干凈。合成方法參考文獻(xiàn)方法[18]。將5.0 mL 50 mg/mL BSA溶液和4.0 mL 1.0×10-2mol/L HAuCl4溶液混合，接著加入1.0 mL不同濃度的AgNO3溶液，室溫振蕩10 min，立即加入1.0 mL 1.0×10-3mol/L NaOH溶液，在37 ℃下反應(yīng)12 h。將反應(yīng)液先使用30 000 MW的濾膜處理，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，去除未反應(yīng)的BSA。再使用水對(duì)其透析48 h(每6 h換一次水)，以除去未反應(yīng)的HAuCl4和NaOH。最后將得到的BSA-Au/AgNCs溶液4 ℃放置以備用。取1 mL溶液凍干后稱(chēng)重，計(jì)算得到最終BSA-Au/AgNCs母液的濃度為3.4 mg/mL。

1.2.2 Hg2+的熒光檢測(cè)取100 μL上述BSA-Au/AgNCs溶液，加900 μL濃度為2.0×10-2mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.0)，得到濃度為0.34 mg/mL的BSA-Au/AgNCs溶液。分別移取1 μL不同濃度的Hg2+溶液加入到1 mL上述BSA-Au/AgNCs溶液中，進(jìn)行熒光測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA-Au/AgNCs的合成及表征

圖1A為BSA-Au/AgNCs在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm處的熒光光譜圖，由圖可見(jiàn)最大發(fā)射波長(zhǎng)為625 nm。這些熒光特征與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[19]，表明實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功合成了BSA-Au/AgNCs。日光下制備的BSA-Au/AgNCs呈棕黃色(如圖1A插圖a)，而在365 nm的紫外燈下顯示出很強(qiáng)的橘紅色熒光，如圖1插圖b所示。

圖1 BSA-Au/AgNCs的熒光光譜(A)和紅外光譜(B)圖Fig.1 Fluorescence spectra(A) and IR spectra(B) of BSA-Au/AgNCsInset a in Fig.A:Image of BSA-Au/AgNCs under the daylight lamp; Inset b:Image of BSA-Au/AgNCs under 365 nm UV light;Inset c:HRTEM image of BSA-Au/AgNCs.

利用高分辨透射電鏡(HRTEM)研究了合成的BSA-Au/AgNCs的尺寸。如圖1插圖c所示，可以觀察到合成的BSA-Au/AgNCs尺寸約4 nm，表明BSA-Au/AgNCs具有高度結(jié)晶的結(jié)構(gòu)。利用紅外光譜表征了BSA-Au/AgNCs的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果如圖1B所示。其中曲線a為BSA-Au/AgNCs的紅外譜，曲線b為BSA的紅外光譜。與BSA的紅外光譜相比，BSA-Au/AgNCs的紅外光譜在1 654 cm-1的特征吸收峰有較為明顯的減弱，這表明反應(yīng)后蛋白質(zhì)的α螺旋結(jié)構(gòu)減少了，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，同時(shí)在蛋白質(zhì)中巰基與Au、Ag形成共價(jià)鍵。

2.2 BSA-Au/AgNCs對(duì)Hg2+的熒光響應(yīng)

考察了Hg2+存在時(shí)BSA-Au/AgNCs為熒光探針熒光信號(hào)變化情況，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，本實(shí)驗(yàn)合成的BSA-Au/AgNCs在625 nm處顯示出很強(qiáng)的熒光(曲線a)，而隨著Hg2+的加入，BSA-Au/AgNCs的熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著降低(曲線b)。圖2的插圖是在365 nm紫外燈下，在不同條件下的BSA-Au/AgNCs的熒光圖。在紫外燈下，單純的BSA-Au/AgNCs呈現(xiàn)出明亮的橙紅色(插圖a)，而加入Hg2+后，明亮的橙紅色幾乎完全褪去，而顯示出微弱的藍(lán)光(插圖b)。這一結(jié)果表明，Hg2+可有效地猝滅BSA-Au/AgNCs的熒光。其原因可能是Hg2+與BSA-Au/AgNCs表面的Au+之間存在著高特異性的Hg2+-Au+噬金屬效應(yīng)(Metallophilic Interactions)，導(dǎo)致BSA-Au/AgNCs的熒光猝滅。所謂的噬金屬效應(yīng)[19]是指一些閉殼層金屬(Closed-shell Metal)原子或離子間存在著的高親和性作用力，如Cu+(3d10)與Ag+(4d10)或Hg2+(5d10)與Au+(5d10)。這些閉殼層金屬間強(qiáng)的相互作用力能夠?qū)崿F(xiàn)某些金屬離子的特異性檢測(cè)。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 Au和Ag配比的選擇固定BSA的用量，調(diào)整HAuCl4和AgNO3的比例，分別合成不同Au、Ag比例的合金簇，并考察不同比例的Au、Ag合金簇的熒光光譜。如圖3所示，當(dāng)Au∶Ag=3∶1時(shí)，得到的合金簇的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)(曲線b)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇Au、Ag比例為3∶1合成BSA-Au/AgNCs。

圖2 加入Hg2+前(a)、后(b)BSA-Au/AgNCs的熒光光譜和紫外燈下圖片F(xiàn)ig.2 Fluorescence spectra and image under UV light of BSA-Au/AgNCs without (a) and with (b) Hg2+a.in the absence of Hg2+;b.in the presence of 3.0×10-8 mol/L Hg2+.

圖3 不同Au、Ag比例BSA-Au/AgNCs的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of BSA-Au/AgNCs with different molar ratiosa.Au∶Ag=4∶1;b.Au∶Ag=3∶1;c.Au∶Ag=2∶1;d.Au∶Ag=1∶1;e.Au∶Ag=0.5∶1.

圖4 Hg2+和BSA-Au/AgNCs(Au∶Ag=3∶1)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 The dynamics curve between BSA-Au/AgNCs(Au∶Ag=3∶1) and Hg2+The final concentration of Hg2+ and BSA-Au/AgNCs are 2.0×10-8 mol/L and 0.34 mg/mL in 0.02 mmol/L PBS buffer(pH=7.0),respectively.

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果有很大影響。實(shí)驗(yàn)考察了Hg2+對(duì)BSA-Au/AgNCs熒光響應(yīng)的情況。從圖4中可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)反應(yīng)10 min后，熒光降低趨于緩慢，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，所有反應(yīng)時(shí)間均設(shè)為10 min.

2.4 線性方程及檢測(cè)限

按照上述優(yōu)化條件，實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度Hg2+對(duì)BSA-Au/AgNCs熒光強(qiáng)度的影響。從圖5A中可以看出，隨著Hg2+濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸降低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Hg2+的濃度在一定范圍內(nèi)時(shí)(2～30 nmol/L)，熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度有著良好的線性關(guān)系，如圖5B所示，回歸方程為：y=-1224.2x(nmol/L)+47319.6，相關(guān)系數(shù)R2為0.9928，方法的檢測(cè)限(S/N=3)為0.6 nmol/L。3次平行實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.6%，方法具有穩(wěn)定性。

圖5 (A)不同濃度Hg2+條件下BSA-Au/AgNCs的熒光光譜；(B)熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度的線性關(guān)系曲線Fig.5 (A) Fluorescence spectra of BSA-Au/AgNCs in the presence of different concentrations of Hg2+;(B) The relationship curve of the fluorescence intensity with Hg2+ concentrationscHg2+ (a-f):0,2,5,12,20,30 nmol/L.

圖6 不同金屬離子的響應(yīng)信號(hào)變化圖Fig.6 Signal changes responding to different metal ionsNote:The concentration of Hg2+ was 1.2×10-8 mol/L and those of other ions were 1.2×10-7 mol/L.

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

選用一些常見(jiàn)的無(wú)機(jī)離子Cu2+、Mn2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+和Cd2+等作為干擾離子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用熒光的改變量ΔF來(lái)表示，定義ΔF=F0-F,其中F0為初始熒光值，F(xiàn)為加入相應(yīng)離子后的熒光值。從圖6中可以看出，同樣條件下，Hg2+對(duì)BSA-Au/AgNCs的熒光具有顯著猝滅作用，而其他金屬對(duì)其則沒(méi)有明顯作用。由此可見(jiàn)，基于BSA-Au/AgNCs的熒光檢測(cè)方法對(duì)Hg2+具有良好的選擇性識(shí)別能力。

2.6 實(shí)際水樣中Hg2+的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)中所用的水樣均采自閩江，在檢測(cè)前靜置過(guò)夜，并通過(guò)濾膜(0.22 mm)過(guò)濾掉不溶物。利用所建立方法在此水樣中進(jìn)行Hg2+的檢測(cè)，結(jié)果并沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)變化，其原因可能是河水中Hg2+的含量低于該方法的檢測(cè)限。在水樣中加入已知濃度的Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示，其回收率在90.1%～107.2%范圍內(nèi)。

表1 河水樣品中Hg2+的檢測(cè)

3 結(jié)論

本文以BSA為模板，以HAuCl4和AgNO3為原料，合成了一種高熒光強(qiáng)度的Au、Ag合金簇BSA-Au/AgNCs。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于Hg2+與BSA-Au/AgNCs表面的Au+存在的高特異性的噬金屬效應(yīng)，因而能顯著猝滅合金簇的熒光信號(hào)。本研究進(jìn)一步以該BSA-Au/AgNCs為熒光探針，開(kāi)發(fā)了一種快速檢測(cè)Hg2+的方法。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，快速，靈敏度較高，不需復(fù)雜儀器；同時(shí)，合成的合金簇綠色環(huán)保。