李婧，南亞萍，袁林江，鄒建旻，王齡偵

(西安建筑科技大學 環(huán)境與市政工程學院 陜西省環(huán)境工程重點實驗室 西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室，陜西 西安 710055)

酶法預處理是一種清潔可行的厭氧消化預處理手段[1]，但其成本高且酶易失活[2]，因此生產(chǎn)廉價高效的水解酶成為酶法預處理需解決的首要問題。若將剩余污泥作為基質培養(yǎng)水解菌(自培養(yǎng))，使其水解利用污泥并產(chǎn)酶，以此作為厭氧消化酶法預處理用酶，即可降低酶法預處理成本，但其產(chǎn)酶效果仍需提高。有報道，Ca2+可促進微生物生長產(chǎn)酶[3]，325種酶的激活均需Mg2+參與[4]。

本文研究Ca2+、Mg2+對污泥自培養(yǎng)產(chǎn)酶的影響，并探討Ca2+、Mg2+對酶活力影響與污泥水解間關系，為提高污泥產(chǎn)酶效率并應用于污泥資源化實踐提供科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

剩余污泥，取自西安市第四污水廠二沉池，靜置24 h棄去上清液，通過0.45 mm篩網(wǎng)過濾以除雜質，添加蒸餾水，配制成濃度為1 500 mg/L左右的污泥，于4 ℃冰箱內保存?zhèn)溆?。實驗時于121 ℃滅菌30 min后使用。滅菌剩余污泥中Ca2+、Mg2+濃度分別為5×10-4，8.3×10-5mol/L，剩余污泥其它性質見表1；無水CaCl2、MgCl2均為分析純；液體培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；細菌：地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis，BNCC189067)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus，BNCC192974)均購自北京北納生物有限公司，分別為高效產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶菌株。

pH5-3E型酸度計；熱電/iCE3300型原子吸收光譜儀；CJ-1S型超凈工作臺；DH-500型電熱恒溫箱；THZ-82型電熱恒溫振蕩器；DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器；Z-36HK型高速冷凍離心機；UV-2600型紫外可見分光光度計；美國熱電Nicolet iS50型傅里葉變換紅外光譜儀；日立F-7000型熒光分光光度計。

表1 剩余污泥性質Table 1 Characters of excess activated sludge

1.2 實驗方法

1.2.1 混合菌劑制備 將菌株于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)活化，培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期(OD600=1.6左右)。取地衣芽孢桿菌混懸液50 mL和蠟狀芽孢桿菌混懸液25 mL混合，使兩菌比例為2∶1。無菌狀態(tài)下10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，并用無菌水重懸，再次離心，反復3次，以去除原混懸液中培養(yǎng)基有機物對后續(xù)實驗中滅菌污泥性質的影響。完成后再加5 mL無菌水，制成菌懸液備用，共制備12支菌懸液。

1.2.2 剩余污泥產(chǎn)酶實驗方法 實驗分兩批進行，但采用同一批次污泥。第1批設置為空白組、0.03，0.06 mol/L Ca2+組，第2批設置為空白組、0.03，0.06 mol/L Mg2+組，每組設兩個平行樣。每批實驗取冰箱保存的濃度為1 500 mg/L的稀釋剩余污泥1 500 mL，充分攪拌混合后，分裝至6個500 mL廣口錐形瓶中，每瓶各250 mL，Ca2+、Mg2+按所需濃度加入對應組別錐形瓶中，空白組不加，121 ℃滅菌30 min。無菌條件下每個錐形瓶中各加入5 mL混合菌劑菌懸液，以無菌透氣塞覆蓋，于30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)7 d，錐形瓶中DO維持在3～4 mg/L。分別于第0，1，2，3，5，7 d測定蛋白酶、淀粉酶活力，第0 d和第7 d測定污泥成分變化和污泥DOM成分變化。

1.3 測定方法

2 結果與討論

2.1 Ca2+、Mg2+對污泥自培養(yǎng)產(chǎn)水解酶效果的影響

2.1.1 Ca2+、Mg2+對污泥自培養(yǎng)產(chǎn)蛋白酶效果分析 Ca2+、Mg2+添加濃度對污泥自培養(yǎng)產(chǎn)蛋白酶的影響見圖1。

由圖1可知，兩批實驗的空白組中蛋白酶活力均呈隨時間增加先快速上升后下降的規(guī)律，分別在第1 d上升至最大值216.69 U/mL和231.04 U/mL。添加0.03 mol/L Ca2+組(圖1a)，污泥中蛋白酶活力在第1 d上升最快，隨后一直呈緩慢穩(wěn)定上升趨勢，在第7 d達最大值340.07 U/mL，較空白組的蛋白酶活力最大值增加了53.94%，由此可知，添加0.03 mol/L Ca2+能有效提高污泥自培養(yǎng)產(chǎn)酶活力，且酶活力上升趨勢較穩(wěn)定。添加0.06 mol/L Ca2+組，在第1 d內快速升至110.95 U/mL，但上升幅度明顯低于空白組和0.03 mol/L Ca2+組，然后維持在穩(wěn)定水平，其7 d內最大值為143.70 U/mL，相較空白組的蛋白酶活力最大值下降了33.68%，在產(chǎn)酶實驗后期，其酶活力始終維持在一較低水平。表明添加0.06 mol/L Ca2+，對污泥產(chǎn)酶不但沒有促進作用，反而產(chǎn)生了抑制。添加Mg2+組(圖1b)中，兩組蛋白酶活力均呈第1 d快速上升趨勢，但酶活力最大值均小于空白組，且兩組酶活力均能維持在較穩(wěn)定范圍內。表明Mg2+不能促進蛋白酶活性，且對酶活有一定抑制，但能夠維持蛋白酶活力穩(wěn)定。

圖1 Ca2+、Mg2+添加濃度對污泥蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of Ca2+，Mg2+ concentrations on protease activity variation of excess activated sludge

2.1.2 Ca2+、Mg2+對污泥自培養(yǎng)產(chǎn)淀粉酶效果分析 Ca2+、Mg2+添加濃度對污泥自培養(yǎng)產(chǎn)淀粉酶的影響見圖2。

圖2 添加不同濃度Ca2+、Mg2+條件下污泥淀粉酶活力變化Fig.2 Amylase activity variation of excess activated sludge with different concentrations of Ca2+，Mg2+

兩批實驗空白組中，淀粉酶活力隨時間的增加均呈先快速上升后下降的規(guī)律，且分別在第1 d上升至最大值215.58 U/mL和204.49 U/mL。添加Ca2+的兩組(圖2a)中，淀粉酶活力在第1 d上升至最大值，分別為351.02，289.44 U/mL，較空白組淀粉酶最大活力分別增加了62.83%，41.54%，但隨時間延長快速下降，表明添加Ca2+能短期內提高淀粉酶活力。添加Mg2+的兩組(圖2b)中，淀粉酶活力均呈隨時間增加先上升后維持穩(wěn)定的趨勢，但兩組的最大淀粉酶活力均小于空白組，表明添加Mg2+對污泥中淀粉酶活力升高無作用，但能維持酶活穩(wěn)定，這與Mg2+對蛋白酶活力影響結果一致。

2.2 污泥成分變化分析

污泥要產(chǎn)生更多水解酶，首先需要污泥本身被利用水解酸化，為研究污泥自培養(yǎng)產(chǎn)酶過程中污泥利用情況，采用FTIR分析污泥成分變化，結果見圖3。

由圖3可知，3 450～3 400 cm-1為O—H或N—H伸縮振動峰，空白組及加Ca2+組(圖3a)污泥在3 450～3 400 cm-1處出現(xiàn)尖峰，而加Mg2+組(圖3b)污泥在3 400～3 200 cm-1處出現(xiàn)鈍峰，這是由于Mg2+與蛋白質絡合，造成光譜變化[8]。2 500～1 900 cm-1是三鍵及累積雙鍵吸收區(qū)，1 643～1 850 cm-1處為羰基振動吸收峰，空白組水解前后均無該兩種峰，加Ca2+、Mg2+組水解7 d后均出現(xiàn)該兩種峰，認為是Ca2+、Mg2+對外加菌的生長代謝及污泥中的化學物質種類有一定影響所致[9]。1 640～1 407 cm-1處為蛋白質肽鍵頻段，加Ca2+、Mg2+組7 d后的污泥中肽鍵都有所增加，表明污泥產(chǎn)酶過程中產(chǎn)生了蛋白，該蛋白有可能是產(chǎn)生的水解酶，也可能是污泥水解過程中產(chǎn)生的其它類蛋白[10]。

2.3 污泥上清液組成成分

污泥中官能團的改變說明其組成成分改變，污泥在一定程度上發(fā)生水解，水解產(chǎn)物可用于污泥自培養(yǎng)中添加的復合菌進一步的生長及產(chǎn)酶。為研究添加Ca2+、Mg2+對產(chǎn)酶的影響與污泥水解產(chǎn)物間關系，對污泥自培養(yǎng)產(chǎn)酶過程中的污泥進行DOM三維熒光分析。

2.3.1 添加Ca2+組 污泥DOM三維熒光分析結果見圖4、表2。

環(huán)境中常見DOM通常分為5類，即微生物瀝出物(微生物生長、代謝、死亡過程中產(chǎn)生的溶解性有機物)、芳香性蛋白質I、芳香性蛋白質II、腐殖酸類、富里酸類[11]。

由圖4、表2可知，第0 d污泥DOM(圖4a)有4個不同類型的熒光峰，分別是微生物瀝出物(峰A)、芳香性蛋白質I(峰B)、芳香性蛋白質II(峰C)、富里酸類(峰E)。其中熒光強度最強的是微生物瀝出物峰，認為是對污泥進行高溫高壓滅菌后，污泥中大部分微生物胞內物質溶出產(chǎn)生的結果[11]。

經(jīng)7 d水解，空白組污泥DOM中(圖4b)出現(xiàn)了3個腐殖酸類峰(峰D)、芳香性蛋白II峰，但芳香性蛋白I峰消失，微生物瀝出物峰減弱但熒光強度仍最強。說明空白組污泥經(jīng)過7 d水解，最初滅菌產(chǎn)生的微生物瀝出物剩余量仍很多，空白組污泥水解很不充分。

添加0.03 mol/L Ca2+組和0.06 mol/L Ca2+組污泥DOM中(圖4c、4d)均出現(xiàn)高熒光強度的腐殖酸類和富里酸類峰，而微生物瀝出物、芳香性蛋白質I、芳香性蛋白質II峰消失，且添加0.06 mol/L Ca2+組中富里酸量顯著高于0.03 mol/L Ca2+組，表明添加0.03 mol/L Ca2+組和添加0.06 mol/L Ca2+組污泥經(jīng)過7 d水解，污泥DOM中微生物瀝出物、芳香性蛋白質I、芳香性蛋白質II均被水解，轉化成難被生物利用的富里酸類和腐殖酸類物質[12]。

表2 添加Ca2+組污泥DOM三維熒光數(shù)據(jù)Table 2 Data analysis of three-dimensional fluorescence of excess activated sludge DOM with different concentrations of Ca2+

2.3.2 添加Mg2+組 污泥DOM三維熒光圖譜分析見圖5、表3。

分組Ex∶Em/nm 熒光強度/AU對應物質(峰)第0d280/3503123微生物瀝出物(A)230/3051424芳香性蛋白I(B)225/3551397芳香性蛋白II(C)第7d空白組365/455916.9腐殖酸類(D)280/3502339微生物瀝出物(A)275/4551422腐殖酸類(D)225/3501163芳香性蛋白II(C)第7d0.03mol/L310/3956248腐殖酸類(D)Mg2+組240/3904444富里酸類(E)第7d0.06mol/L365/450422腐殖酸類(D)Mg2+組320/400415腐殖酸類(D)280/345622微生物瀝出物(A)280/455381腐殖酸類(D)225/345378芳香性蛋白II(C)

由圖5和表3可知，第0 d滅菌污泥DOM(圖5a)中有3個不同類型的熒光峰，分別微生物瀝出物、芳香性蛋白質I和芳香性蛋白質II峰，其中熒光強度最強的是微生物瀝出物峰。經(jīng)過7 d水解，空白組污泥DOM中(圖5b)出現(xiàn)4個熒光峰，包括兩個腐殖酸類、微生物瀝出物、芳香性蛋白II峰，其中熒光強度最強的是微生物瀝出物峰，其結果與Ca2+對污泥DOM影響實驗中空白組的基本一致，表明空白組污泥并沒有被水解利用。

添加0.03 mol/L Mg2+組污泥DOM中(圖5c)出現(xiàn)腐殖酸類和富里酸類2個不同類型的熒光峰，其中熒光強度最強的是腐殖酸峰。表明添加0.03 mol/L Mg2+組污泥經(jīng)過7 d水解，最初滅菌產(chǎn)生的微生物瀝出物、芳香性蛋白質I和II已被徹底水解利用，生成了腐殖酸類和富里酸類物質，這與添加0.03 mol/L Ca2+組污泥水解趨勢一致。添加0.06 mol/L Mg2+組污泥DOM中(圖5d)物質類型與空白組相似，表明添加0.06 mol/L Mg2+并沒有促進污泥的有效水解。這也與添加Mg2+組中酶活力小的結果一致。因此，在添加Mg2+對污泥水解影響實驗中，相較于添加0.06 mol/L Mg2+組，添加0.03 mol/L Mg2+組有更多污泥DOM被水解菌水解，溶出腐殖酸、富里酸類物質。

由上可知，添加0.03，0.06 mol/L Ca2+和0.03 mol/L Mg2+均能促進微生物水解剩余污泥，但同時也生成了難被生物利用的腐殖酸和富里酸類物質。腐殖酸類物質可與酶活性中心位點結合，從而抑制酶活性[13]，可導致酶活力降低，但同時，金屬離子又能夠通過與腐殖酸結合，屏蔽腐殖酸對酶活性的抑制[14-15]。實驗中酶活力變化正是由于污泥水解產(chǎn)酶過程中生成的水解產(chǎn)物與加入的Ca2+、Mg2+的相互影響導致：空白組中第1 d水解酶活力上升最快，而后期水解酶活力下降迅速，污泥上清液中成分也以微生物瀝出物、腐殖酸等為主，表明上清液中的腐殖酸等抑制物對水解酶活力有明顯抑制作用；加入0.03 mol/L Ca2+后，加入的Ca2+與污泥水解產(chǎn)物中腐殖酸類物質結合，減少了腐殖酸對酶的抑制，水解酶活力升高，高酶活力反過來又促進污泥的水解，為微生物提供更多的有機物，以促進微生物生長代謝及產(chǎn)酶。Mg2+對酶活力沒有促進作用，主要原因可能是金屬離子與腐殖酸以等價陽離子交換形式結合，從而屏蔽腐殖酸對酶的抑制以對酶活力產(chǎn)生影響，而等價離子交換能力大小與原子序數(shù)大小成正比[16]，Ca2+原子序數(shù)大于Mg2+，因此Ca2+對腐殖酸類的屏蔽效果要優(yōu)于Mg2+，最終表現(xiàn)為Ca2+對酶活力產(chǎn)生影響，而Mg2+沒有，但Mg2+能維持酶活力相對穩(wěn)定的原因還有待研究。

從不同濃度Ca2+對酶活力影響結果來看，只有0.03 mol/L Ca2+促進酶活力提高，0.06 mol/L Ca2+卻抑制了酶活。據(jù)Tipping等研究發(fā)現(xiàn)，過量金屬離子會與必需金屬元素競爭酶上的硫化物和氧結合位點，或破壞核酸和蛋白質結構、干擾氧化磷酸化和滲透壓平衡等[17]。所以本實驗中0.06 mol/L Ca2+雖能促進污泥水解，但是對蛋白酶活力有抑制作用，原因可能是過量的Ca2+與必需金屬元素競爭，抑制了微生物的生長代謝，而使微生物產(chǎn)酶效果不佳。

3 結論

(1)以剩余污泥為培養(yǎng)基，加入地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌進行污泥自培養(yǎng)產(chǎn)水解酶，添加0.03 mol/L Ca2+，可使蛋白酶活力第1 d快速升至246.14 U/mL，后持續(xù)上升并在第7 d時酶活達最大值340.07 U/mL，蛋白酶活力最大值較空白組增加了53.94%。淀粉酶活力在第1 d快速升至351.02 U/mL后快速下降，第7 d酶活力為70.79 U/mL，淀粉酶活力最大值較空白組增加了51.93%，表明添加0.03 mol/L Ca2+可以提高滅菌污泥自培養(yǎng)產(chǎn)水解酶效果。

(2)添加0.03 mol/L或0.06 mol/L Mg2+，不能提高產(chǎn)水解酶效果，但能維持水解酶活力穩(wěn)定。

(3)添加合適濃度Ca2+、Mg2+，能強化剩余污泥自培養(yǎng)產(chǎn)酶過程中污泥降解，促進污泥上清液中有機物水解。