史曉虎 樸元林 尹德海 石 玥 孫 瑩

糖尿病一旦出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿，病情常難以逆轉，往往發(fā)展為終末期腎臟病[1～3]。足細胞脫落、凋亡以及功能缺失是糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，研究足細胞結構和功能異常的機制，從而尋找防治措施可能是獲得DKD有效治療手段的關鍵途徑。既往研究證實黃芪菟箭合劑可以減少糖尿病大鼠尿蛋白[4]。本研究從白蛋白尿排泄相關的足細胞作為研究的著眼點，探討黃芪菟箭合劑對足細胞保護及其調(diào)亡相關指標的影響，為臨床治療DKD提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1.主要材料：(1)實驗動物：清潔級雄性SD大鼠，體質量140～160g，鼠齡5周，購自北京斯貝福神武技術有限公司(No.11401500013730)，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所動物房[動物房許可證號：SCXK(京)2016-0002]。(2)造模與分組：大鼠適應性飼養(yǎng)3天后，隨機取6只作為正常對照組(CON組)；其余大鼠禁食12h后予2%鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)(臨用前溶于pH值4.2枸櫞酸鹽緩沖液)65mg/kg體重一次性腹腔注射。72h后，尾靜脈取血測禁食12h血糖，以血糖≥16.7mmol/L，為造模成功。未成模大鼠均處死。糖尿病大鼠隨機分為3組，即糖尿病對照組(DM組)6只、黃芪菟箭合劑治療組(CM組)8只、纈沙坦組(V組)8只。CM組以10g/(kg·d)灌胃黃芪菟箭合劑；V組以40mg/(kg·d)灌胃纈沙坦。

2.主要試劑：(1)黃芪菟箭合劑顆粒劑[4]購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。(2)其他試劑： STZ(美國Sigma公司)； 抗Neprin抗體[EPR20993](ab216341)、抗ZO-1 tight junction蛋白抗體(ab96587)、抗NF-κB p65抗體[E379](ab32536)、抗caspase-3抗體[E87](ab32351,英國Abcam公司)； Tris.Hcl(0826)、氯化鈉(E529)、甘氨酸(M103)、SDS(0837,美國Amersco公司)；TEMED(17131201,美國GE公司)、APS(A3678,美國Sigma公司)、巰基乙醇(M3148,美國Sigma公司)。

3.組織標本的收集和處理：干預治療12周后，處死前一天將大鼠置于代謝籠中，禁食不禁水收集夜間12h尿液，待測尿肌酐和尿白蛋白。大鼠的體重、右腎重用電子天平測量。頸動脈取血，離心取血清待測；開胸，予20mmol/L氟化鈉(溶于PBS)行經(jīng)心臟體循環(huán)灌洗腎臟，直至腎臟顏色變淡，迅速剝離雙腎，置于冰上，取部分腎皮質置于10%甲醛溶液固定用于常規(guī)石蠟包埋和病理切片；其余腎皮質迅速置于干燥凍存管中，置入液氮中保存，應用Western blot法檢測。

4.檢測指標及方法：(1)使用全自動生化分析儀 (日本第一化學制品公司提供試劑盒，日本Olympus 1000)檢測血肌酐(SCr)、尿素(Urea)、血糖(Glu)、和尿肌酐(Ucr)。(2)使用ELISA試劑盒檢測大鼠尿白蛋白，并根據(jù)尿白蛋白和尿肌酐值計算大鼠尿白蛋白肌酐比(ACR)。(3)參考文獻[5],以體重進行校正，計算肌酐清除率(CCR)。采用公式：CCR=Ucr×尿量(12h)/Scr×1000/體重(g)/720min。(4)Western blot法檢測腎組織ZO-1、nephrin、NF-κB、caspase-3蛋白表達：配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠 (SDS-PAGE)凝膠，50mg加入500μl RIPA蛋白裂解液，勻漿裂解組織，14000r/min，4℃離心10min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣30μg，電泳后轉移至PVDF膜, 5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，洗膜后分別加入稀釋一抗，4℃過夜, 洗膜3次后，加入二抗，室溫孵育, 洗膜后加增強化學發(fā)光試劑(ECL)后置于化學發(fā)光檢測儀檢測信號。用ImageJ軟件對 Western blot法檢測條帶進行定量分析，以目的條帶和GAPDH條帶積分光密度值比值作為最終結果。

結 果

1.各組大鼠體重、血糖、尿量、腎/體重比：與CON組比較，所有糖尿病大鼠組包括DM組、CM組及V組的血糖、腎/體重比、12h尿量均顯著增高(P<0.05)，體重則顯著下降(P<0.05)。與DM組比較， CM組和V組12h尿量及腎/體重比均顯著降低(P<0.05)，但CM組和V組12h尿量及腎/體重比比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

表1 各組大鼠體重、血糖、尿量、腎/體重比

CON組.正常對照組；DM組.糖尿病對照組；CM組.黃芪菟箭合劑治療組；V組.纈沙坦組；與CON組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

2.各組大鼠血肌酐、尿素、尿肌酐、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率：與CON組比較，糖尿病各組大鼠Urea、ACR、CCR均明顯升高(P<0.05)，Ucr則明顯下降(P<0.05)。CM組和V組 的ACR、CCR顯著低于DM組(P<0.05)，CM組與V組之間的ACR及CCR比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表2)。

表2 各組大鼠血肌酐、尿素、尿肌酐、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率

CON組.正常對照組；DM組.糖尿病對照組；CM組.黃芪菟箭合劑治療組；V組.纈沙坦組；與CON組比較,*P<0.05;與DM組比較,#P<0.05

3.各組大鼠腎皮質ZO-1、nephrin、NF-κB、caspase-3蛋白表達情況：(1)ZO-1及nephrin蛋白表達：糖尿病各組大鼠的腎皮質ZO-1及nephrin顯著低于CON組(P<0.01)；CM 組和V組的腎皮質ZO-1及nephrin蛋白表達顯著高于DM 組(P<0.05,圖1、表3)。(2)NF-κB及caspase-3蛋白表達：DM組腎皮質中NF-κB和caspase-3蛋白表達顯著高于CON組(P<0.01)；與DM組比較，CM組腎皮質NF-κB和caspase-3蛋白表達均顯著下降(P<0.01)；與DM組比較，V組腎皮質caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.01)，而其NF-κB蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1及表3)。

圖1 各組大鼠腎皮質ZO-1、nephrin、NF-κB、caspase-3蛋白表達情況

討 論

足細胞病變導致的足細胞脫落分離，可致白蛋白尿的出現(xiàn)[6]。在糖尿病腎病的早期階段，足細胞對裂孔隔膜蛋白或細胞骨架蛋白、如緊密連接蛋白ZO-1(zonulaaoccludens protein-1)、nephrin的合成表達減少，足細胞對腎小球基膜的黏附性下降，足細胞脫落，造成足細胞間的裂孔隔膜的完整性破壞，從而導致蛋白尿的出現(xiàn)[7]。本研究以STZ誘導糖尿病大鼠模型，經(jīng)12周，糖尿病大鼠出現(xiàn)腎臟體積增大、腎/體重比增加、ACR、CCR顯著升高，提示糖尿病大鼠腎臟出現(xiàn)高濾過高灌注狀態(tài)，已經(jīng)出現(xiàn)了DKD典型的白蛋白尿，成功建立了DKD大鼠模型。與正常大鼠比較，DKD大鼠的腎皮質免疫印跡相關結果提示，具有維持腎小球濾過膜完整性的的ZO-1及nephrin的表達顯著降低。本研究經(jīng)黃芪菟箭合劑干預12周，DKD大鼠的腎/體重比、ACR與CCR均顯著下降，這證實黃芪菟箭合劑具有降低DKD尿白蛋白排除率，有效緩解DKD腎臟高濾過，且此機制與降糖無關。本研究觀察到黃芪菟箭合劑能升高糖尿病大鼠腎組織具有足細胞保護作用的ZO-1及nephrin的蛋白表達，具有直接的足細胞保護作用。

NF-κB作為一個轉錄因子蛋白家族，是細胞內(nèi)多個通路的中心環(huán)節(jié)，其活化可調(diào)節(jié)多種化學趨化因子和細胞黏附分子的轉錄與表達、成纖維細胞的增殖合分化、細胞外基質的交聯(lián)反應以及細胞凋亡等過程。研究表明在DKD患者及STZ誘導的DM大鼠中均存在NF-κB激活，且DKD患者NF-κB激活與尿白蛋白排出率呈正相關[8]。抑制糖尿病狀態(tài)下NF-κB途徑的激活有可能通過抑制其下游事件的發(fā)生，包括炎性反應、巨噬細胞浸潤、細胞凋亡等，從而減少尿白蛋白排出，起到腎保護作用。研究觀察到DM大鼠腎皮質NF-κB蛋白表達顯著升高，細胞凋亡相關caspase-3蛋白表達顯著升高。黃芪菟箭合劑可抑制糖尿病大鼠腎皮質NF-κB表達，降低細胞凋亡相關的caspase-3蛋白的表達，提示黃芪菟箭合劑有可能通過抑制NF-κB途徑和抑制凋亡，從而起到保護足細胞，減少白蛋白排出，進而延緩DKD進展。

表3 各組大鼠腎皮質ZO-1、nephrin、NF-κB、caspase-3蛋白相對表達量

CON組.正常對照組；DM組.糖尿病對照組；CM組.黃芪菟箭合劑治療組；V組.纈沙坦組。與CON組比較,*P<0.01；與DM組比較,#P<0.05,##P<0.01

近年來研究表明，中醫(yī)藥治療DKD的機制與其抑制導致病情惡化的指標并改善保護腎臟及延緩病情發(fā)展的指標有關[9～13]。中醫(yī)藥認為DKD(中醫(yī)的消渴腎病)的主要特點為“消渴小便白濁”，與西醫(yī)把白蛋白尿作為DKD顯著臨床特征一致[14]。歷代醫(yī)家多數(shù)認為脾腎兩虛、瘀血水濕內(nèi)阻是其主要病機：脾腎虛衰，氣虛不固攝，精微不固，從溺而出；氣虛不行血，血滯成瘀血；氣化失常，水濕停聚則見水腫。黃芪菟箭合劑以黃芪、菟絲子補益脾腎為君；以鬼箭羽活血、漢防己利水泄?jié)駶峁矠槌妓?，具有補益脾腎、益氣固精、活血利水(濕)的作用。中藥黃芪菟箭合劑立法、配伍組成符合消渴腎病的主要中醫(yī)病機，實驗證實對DKD大鼠能減少尿白蛋白排出(尿濁減少)，有較大的臨床應用價值。