周維利，公為紅，王 坤

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101）

身痛逐瘀湯是清代名醫(yī)王清任《醫(yī)林改錯》[1]中的五大逐瘀湯之一，己入選國家中醫(yī)藥管理局公布的第一批100種古代經(jīng)典名方目錄[2]，原文記載，“凡肩痛、臂痛、腰痛、腿痛，或周身疼痛，總名曰痹癥。明知受風寒，用溫熱發(fā)散藥不愈；明知有濕熱，用利濕降火藥無功。久而肌肉消瘦，議論陰虧，隨用滋陰藥又不效。至此便云：病在皮脈，易于為功；病在筋骨，實難見效。因不思風寒濕熱入皮膚，何處作痛。入于氣管，痛必流走；入于血管，痛不移處。如論虛弱，是因病而致虛，非因虛而致病?！欧筋H多，如古方治之不效，用身痛逐瘀湯”。組方為白秦艽一錢，川芎二錢，桃仁三錢，紅花三錢，甘草二錢，羌活一錢，沒藥二錢，當歸三錢，靈脂二錢（炒），香附一錢，牛膝三錢，地龍二錢（去土），水煎服。據(jù)學者邱隆等[3-6]考證，清代1兩約合37.3 g，每處方折合現(xiàn)代劑量約92.5 g，適宜成顆粒劑，便于患者服用。

身痛逐瘀湯顆粒至今未見有關制劑提取方面報道，本實驗以川芎和當歸中阿魏酸和紅花中的羥基紅花黃色素A含量為評價指標，對提取工藝進行了優(yōu)化，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

儀器：FA1204C電子分析天平（上海天美天平儀器有限公司），高效液相色譜儀（日本島津），LC-15C泵，SPD-15C檢測器，島津Shimpack VP-ODS（C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

對照品：阿魏酸（10 mg，110773-201614）；羥基紅花黃色素A（10 mg，111637-201609）圴購自中國食品藥品檢定研究院。

試劑：乙腈、甲醇和磷酸為均為色譜純，水為重蒸去離子水，其余試劑均為分析純。

藥材：均購自濟南漱玉平民大藥房有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提正交試驗設計

分別按身痛逐瘀湯顆粒處方稱取白秦艽18.5 g，川芎37 g，桃仁55.5 g，紅花55.5 g，甘草37 g，羌活18.5 g，沒藥37 g，當歸55.5 g，靈脂（炒）37 g，香附18.5 g，牛膝55.5 g，地龍（去土）37 g，共9份，每份計462.5 g，參考相關文獻[7-9]，選取加水量、提取次數(shù)與時間3個因素，每個因素3個水平，進行L9(34)試驗，以提取液中阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量為指標進行評價，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

2.2 阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量測定[10-11]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：島津Shimpack VP-ODS（C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相（A）乙腈-0.05 %磷酸（B）遞度洗脫，檢測波長0～15 min，210 nm；15～100 min，290 nm；50～50 min，254 nm，流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl，遞度洗脫系統(tǒng)見表2。

表2 梯度洗脫系統(tǒng)

2.2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取阿魏酸和羥基紅花黃色素A對照品適量，置入棕色量瓶，加50 %甲醇制成每1 ml含阿魏酸8 μg和羥基紅花黃色素A 100 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密移取提取液10 ml，水浴蒸至近干，加50 %甲醇20 ml，分次轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶，超聲處理（功率200 W，頻率50 kHz）30 min，冷卻至室溫，加50 %甲醇至刻度，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 按身痛逐瘀湯顆粒提取方法制備陰性提取液，方法同2.2.3項，得陰性樣品溶液。

2.2.5 線性與范圍 取阿魏酸和羥基紅花黃色素A對照品溶液，注入高效液相色譜儀，以濃度C（μg/ml）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線，阿魏酸回歸方程為A=398 301C-206 698，R2=0.9996；在1.516～13.644 μg/ml濃度范圍內(nèi)，阿魏酸峰面積值與濃度具有良好線性關系；羥基紅花黃色素A回歸方程為A=550 306C-272 081，R2=0.9997；在20.01～181.26 μg/ml濃度范圍內(nèi)，羥基紅花黃色素A峰面積值與濃度具有良好線性關系。

2.2.6 精密度試驗 取阿魏酸對照品溶液（7.58 μg/ml）與羥基紅花黃色素A對照品溶液（100.7 μg/ml）分別注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，峰面積RSD為0.47 %與0.62 %，儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 取身痛逐瘀湯顆粒樣品6份，按“2.2.3供試品溶液制備”，進行含量測定，計算阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量RSD，含量RSD為1.56 %與1.31 %，方法重復性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一身痛逐瘀湯顆粒溶液分別于0，3，6，9和12 h進樣，記錄峰面積，計算峰面積積分值的RSD，結(jié)果RSD為1.15 %與1.23 %，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 最佳工藝確定

正交試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。以提取液中阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量為提取評價指標，影響因素大小均為A＞B＞C，因素A2與A3、B2與B3、C2與C3均無明顯差別，直觀最佳工藝為A3B3C3（加8倍量水提取3次，每次80 min），綜合考慮，優(yōu)選工藝為A2B2C2（加7倍量水提取2次，每次60 min）。

表3 正交試驗設計與結(jié)果

表4 羥基紅花黃色素A含量方差分析

2.4 工藝驗證

稱取身痛逐瘀湯顆粒處方中各藥材6份，每份462.5 g，分別按A3B3C3（加8倍量水提取3次，每次80 min）和A2B2C2（加7倍量水提取2次，每次60 min）各提取3次，結(jié)果見表5。

表5 提取工藝驗證試驗結(jié)果表

結(jié)果表明，直觀工藝與優(yōu)選工藝無明顯差異，最終確定提取工藝為藥材加7倍量水提取2次，每次60 min，該提取工藝驗證3次，阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量穩(wěn)定。

3 討論

3.1 古代經(jīng)典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定經(jīng)典名方制劑的制備方法應與古代醫(yī)籍記載基本一致，為保持經(jīng)典名方傳統(tǒng)醫(yī)藥的特點，結(jié)合處方中有效成分的理化性質(zhì)，選擇了水提取法，通過預實驗發(fā)現(xiàn)藥材浸泡24 h后吸水量約為藥材的2倍，浸泡時間多于30 min時對提取結(jié)果幾乎沒有影響，為了提高提取效率，藥材均浸泡30 min。根據(jù)預實驗結(jié)果，加水量于藥材量5倍與多于8倍量藥材時，提取效果均不理想。故正交試驗提取中加水量6、7、8倍量3個水平進行了正交試驗設計優(yōu)選，并對處方中藥材的有效成分阿魏酸和羥基紅花黃色素A含量做了測定，優(yōu)選出了較為合理的提取工藝。

3.2 身痛逐瘀湯顆粒由十二味中藥組成，提取液成分復雜且極性跨度大，當歸、川芎共同主要成分是阿魏酸，紅花主要成分是羥基紅花黃色素A，采用梯度洗脫可使檢測峰得到良好分離。