李用珍，劉兆訊，王軍軍，張 英，王龍江*

（1.山東達因海洋生物制藥股份有限公司，山東 榮成 264300；2.威海海洋職業(yè)學院 食品工程系，山東 榮成264300）

多尼培南（doripenem，S-4661）為新型β-內酰胺碳青霉烯類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、對多種G+菌和G-菌均有很強的抗菌活性[1-2]。該品種由日本鹽野義制藥株式會社開發(fā)，于2005年在日本上市，2007年10月美國FDA批準該藥注射劑用于臨床治療多種細菌引起的復雜性腹腔內感染及多種細菌引起的復雜性泌尿道感染。在β-內酰胺類抗生素所致的速發(fā)型過敏反應中，藥物分子本身只是半抗原，藥物中存在的高分子聚合物才是引發(fā)速發(fā)型過敏反應的真正過敏原[3]，控制β-內酰胺抗生素中聚合物的含量是減少臨床中過敏反應的有效措施[4]。彭潔等[5]采用高效液相色譜法（HPLC）發(fā)現(xiàn)注射用多利培南中的雜質，并使用液相色譜-質譜法（LC-MS）推測雜質可能為多利培南的二聚物，但未對其他可能存在的高分子聚合物進行控制。本文采用凝膠色譜法對多尼培南原料藥中的聚合物加以控制，對凝膠色譜柱、檢測波長、流動相等加以優(yōu)化，并在此基礎上進行了相應的方法學驗證，為確保多尼培南原料藥的質量提供技術支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695-2489，e2695-2998高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AB204-S，AB265-S電子天平（梅特勒-托利多）；TSK-GEL G2000SW色譜柱（7.5 mm×600 mm，10 μm，Tosoh Corporation）；Sephadex G-10葡聚糖凝膠柱（10 mm×300 mm，40～120 μm，大連依利特）；pHS-3F型pH計（雷磁-上海儀電）。

1.2 試藥

無水磷酸二氫鈉，無水磷酸氫二鈉（分析純，國藥集團）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；多尼培南原料藥（自制，批號：160801，160802，160803）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：TSK-GEL G2000SW（7.5 mm×600 mm，10 μm）葡聚糖凝膠柱；流動相：pH 7.0磷酸鹽緩沖液[5 mmol/L磷酸氫二鈉溶液-5 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（61:39）]:乙腈=90:10，流速：0.7 ml/min，檢測波長：298 nm，柱溫：30 ℃。

取多尼培南供試品（批號：160801）約20 mg，精密稱定，置入10 ml量瓶，加0.01 mol/L NaOH溶液1 ml，室溫下放置5 min，加0.01 mol/L HCl中和后，加純化水溶解并定容至刻度。取上述堿破壞溶液20 μl注入液相色譜儀，理論塔板數(shù)按多尼培南峰計不低于3000，主峰與高分子聚合物峰的分離度≥1.5。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗HPLC圖譜

2.2 供試品溶液制備

取供試品（批號：160801）約20 mg，精密稱定，置入10 ml量瓶，加純化水溶解并定容至刻度，搖勻制備成每1 ml約含2 mg的溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 強制破壞實驗 取多尼培南供試品（批號：160801）適量，精密稱定，制成每1 ml約含2 mg的溶液 ，精密量取10 ml，按表2條件進行強制破壞，以考察在各種降解條件下高分子聚合物對主成分的影響，結果見表1，圖2～5。

表1 多尼培南高分子聚合物強制降解試驗結果

圖2 堿破壞樣品與供試品HPLC圖譜對比

圖3 酸破壞樣品與供試品HPLC圖譜對比

圖4 氧化破壞樣品與供試品HPLC圖譜對比

圖5 高溫、高濕、光照破壞樣品與供試品HPLC圖譜對比

2.3.2 溶液穩(wěn)定性試驗 取供試品約20 mg，置入10 ml量瓶，精密稱定，加純化水溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1 ml約含2 mg的溶液，作為供試品溶液。室溫下，分別于0，1，2，3，4，5 h精密量取供試品溶液20 μl，注入色譜儀，考察供試品溶液的穩(wěn)定性，結果表明室溫下5 h內，不同時間點供試品主峰峰面積的相對偏差（RD）分別為-0.10 %，-0.36 %，-0.15 %，-0.19 %，-0.46 %，均小于0.5 %；高分子聚合物峰面積的RD分別為1.85 %，1.31 %，1.20 %，1.53 %，2.53 %，均小于5.0 %，符合要求。

2.3.3 檢測限和定量限 逐步稀釋供試品溶液，自動進樣，記錄色譜圖，計算信噪比。多尼培南溶液濃度約為0.04 μg/ml時，主峰的S/N為3～4，所測3份檢測限溶液峰面積的RSD≤10.0 %（0.72 %）；溶液濃度約為0.1 μg/ml時，主峰的S/N為9～10，所測6份定量限溶液的峰面積的RSD≤10.0 %（0.71 %）。

2.3.4 線性關系試驗 在0.1～8 μg/ml 濃度范圍內選取1.007，2.014，4.028，6.042 ，8.056 μg/ml 5個濃度，以濃度（C，μg/ml）對峰面積（A）進行線性回歸，得回歸方程：A=29 789C-1381.7，相關系數(shù)r=0.9999。結果表明：多尼培南在0.1～8 μg/ml范圍內峰面積與濃度的線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗

2.3.5.1 重復性試驗 取同一批多尼培南（批號：160801），精密稱定6份，按2.1項色譜條件測定，主峰前雜質峰面積之和與樣品質量的比值（A/M）的RSD為1.14（n=6），小于2.0 %，重復性滿足要求。

2.3.5.2 中間精密度試驗 取同一批多尼培南，精密稱定12份，由兩位分析員分別在兩天、兩臺不同儀器上按2.1項色譜條件測定，A/M的RSD為1.59 %（n=12），小于2.0 %，中間精密度滿足要求。

2.3.6 耐用性試驗 分別改變流速、流動相pH、乙腈比例及更換色譜柱，其余條件不變，分別制備系統(tǒng)適用性試液和供試品溶液，以系統(tǒng)適用性試驗和供試品的檢測結果評價方法的耐用性，結果見表2。由表2可見，原色譜條件供試品檢測結果與改變色譜條件后檢測結果RD在±2 %以內，說明此方法具有良好的耐用性。

表2 耐用性試驗結果

2.4 樣品測定

取本品（批號：160801，160802，160803）適量，按2.1項色譜條件測定樣品中的聚合物的含量，3批樣品中聚合物的含量分別為0.11 %，0.11 %，0.11 %。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

配制2 mg/ml多尼培南溶液，采用TSK-GEL G2000SW色譜柱，在液相色譜儀（PDA檢測器）上掃描200～400 nm區(qū)間的光譜圖。由圖譜可見，多尼培南主成分和主峰前的高聚物峰均在298 nm附近有最大吸收，故檢測波長選擇298 nm。

3.2 色譜柱的選擇

Sephadex G-10交聯(lián)葡聚糖凝膠柱在β-內酰胺抗生素高分子聚合物的檢測中已得到廣泛應用[6-13]。以2 mg/ml多尼培南溶液作為供試品溶液，分別采用Sephadex G-10（10 mm×300 mm，40～120 μm）及TSK-GEL G2000SW（7.5 mm×600 mm，10 μm）兩種凝膠色譜柱對多尼培南中的高分子聚合物進行分析。結果顯示，采用G-10凝膠柱時主峰峰展較寬，對于高分子雜質分離不利；而TSKGEL G2000SW主峰的峰形較好，因其粒徑小導致其理論塔板數(shù)高，分離效率高，能有效分離高分子聚合物與主成分，故選擇TSK-GEL G2000SW作為多尼培南原料藥聚合物控制的色譜柱。

3.3 流動相pH的選擇

鑒于多尼培南在酸性或堿性，尤其是堿性條件下易降解，進一步產(chǎn)生高分子聚合物雜質，結合TSK-GEL G2000SW色譜柱適用范圍為2.5～7.5，分別選擇pH 7.0，6.5，6.0，5.5的磷酸緩沖鹽[5 mmol/L磷酸二氫鈉-5 mmol/L磷酸氫二鈉（61:39）]-乙腈=95:5）進一步研究。結果顯示，隨著pH值的降低，主峰及高聚物的保留延后，從分離度及主成分的理論塔板數(shù)來看，pH值對高聚物的檢測無顯著影響，鑒于多尼培南在酸、堿性條件下均不穩(wěn)定，故選擇流動相的pH為7.0。

3.4 流動相離子強度的選擇

分別選擇0.005，0.01，0.05 mol/L不同離子強度的流動相進行考察。隨著離子強度的增加，多尼培南高聚物因其自身的氨基、羧基發(fā)生解離，高聚物峰面積逐漸減小，故選擇檢測的離子強度選擇0.005 mol/L。

3.5 計算方法的選擇

由于高聚物本身不穩(wěn)定，對照品不易制備，以外標法定量有一定的難度。選擇自身對照法（1 %自身對照溶液）和面積歸一化法進行比較，結果見表3。

表3 不同計算方式結果比較

由表3可見，自身對照法和面積歸一化法檢測聚合物結果變化不明顯，面積歸一化法檢測結果大于自身對照法檢測結果，選擇面積歸一化法計算聚合物含量。

4 結論

相對于第一代碳青霉烯類藥物在體內易被腎脫氫肽酶（DHP-1）水解，多尼培南具有與細菌青霉素結合蛋白（PBPS）親和力強、抗菌活性高、對DHP-1穩(wěn)定的特點，具有更好的臨床應用價值和市場前景，對多尼培南原料藥中的高分子聚合物進行控制，是減少臨床致敏反應的有效措施。本文采用TSK凝膠色譜系統(tǒng)，通過對檢測波長、色譜柱、流動相pH值及離子強度的篩選，初步建立了控制方法，并對其進行了全面的方法學驗證，該方法簡便、靈敏、準確、專屬性強，可用于多尼培南高分子聚合物的檢查。