張治云，姜鷹雁，劉榮磊，劉亞方，陳建英

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

玻璃酸及其鹽（hyaluronan，HA）是生物體內(nèi)廣泛存在的一種酸性黏多糖，在人體中主要分布于軟骨、關(guān)節(jié)滑液、眼玻璃體和皮膚中，通常使用其鈉鹽，即玻璃酸鈉（sodium hyaluronate，SH）[1]。SH由(1→4)-D-葡糖醛酸-β-(l→3)-D-N-乙酰葡糖胺的雙糖單位重復(fù)連接構(gòu)成[2]，廣泛應(yīng)用于眼科、骨科、保健食品、化妝品等領(lǐng)域[3]。SH對皮膚具有顯著的保濕、抗衰老、營養(yǎng)、修復(fù)等作用，且使用安全，在化妝品中的應(yīng)用日趨廣泛[4-6]。硅烷化玻璃酸復(fù)合物（silanol hyaluronate compound，SHAC）是HA的二甲基硅烷醇衍生物，實(shí)驗(yàn)研究證明其無皮膚刺激性、無細(xì)胞毒性，相比SH具有更好的保濕性能和促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖作用[7]。SHAC中有機(jī)硅含量可反映SHAC的硅烷化程度，本文采用硅鉬藍(lán)比色法測定硅烷化玻璃酸復(fù)合物中有機(jī)硅含量，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津）；Agilent 8454紫外-可見分光光度計(jì)（美國安捷倫）；XS205電子分析天平（瑞士 Mettler）；馬弗爐（魯龍 SX2-4-10，山東魯龍）。

1.2 材料

鉬酸銨（天津市大茂化學(xué)試劑廠，優(yōu)級純，批號：20141123）；抗壞血酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純，批號：20150216）；硅酸鈉（天津科密歐，優(yōu)級純，批號：20141107）；草酸（天津科密歐，分析純，批號：20150321）；濃硫酸（天津科密歐，分析純，批號：20140619）；無水乙醇（天津康科德，色譜純，批號170804）；鹽酸（國藥集團(tuán)，分析純，批號20180223）；硅烷化玻璃酸復(fù)合物（山東福瑞達(dá)生物工程公司，批號20170920，20171123，20180323）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 鉬酸銨溶液 稱取鉬酸銨四水合物5.0 g，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水適量超聲使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.1.2 混合酸溶液 稱取草酸5.0 g，置入100 ml聚乙烯量瓶，加3 mol/L的硫酸溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.1.3 抗壞血酸溶液 稱取抗壞血酸2.0 g，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.1.4 硅標(biāo)準(zhǔn)溶液 稱取硅酸鈉（Na2SiO3·9H2O）1.000 g，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為硅儲備液；精密量取硅儲備液1.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，作為硅標(biāo)準(zhǔn)溶液（含Si 9.88 μg/ml），備用。

2.1.5 樣品溶液 稱取硅烷化玻璃酸復(fù)合物溶液約10.0 g，精密稱定，置鎳坩堝中，置電爐上蒸干，殘?jiān)徛裏胱浦镣耆炕民R弗爐中于700 ℃灼燒4 h，使其充分灰化；取出，冷卻至室溫，加入氫氧化鈉4 g，蓋上坩堝蓋，置于馬弗爐中，逐漸升溫至550 ℃熔融30 min，取出冷卻至室溫，置于250 ml聚乙烯燒杯內(nèi)，加沸水適量，超聲使溶解，將浸提液轉(zhuǎn)移至500 ml聚乙烯量瓶，用沸水分?jǐn)?shù)次洗滌坩堝和坩堝蓋，洗液并入量瓶中，加鹽酸調(diào)pH至6～7，用水稀釋至刻度，搖勻。

2.2 樣品測定方法

精密量取樣品溶液5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水稀釋至20 ml，加0.5 mol/L硫酸溶液5 ml，無水乙醇5 ml，搖勻，加鉬酸銨溶液5 ml，室溫放置10 min，加入混合酸溶液10 ml，抗壞血酸溶液5 ml，立即混勻，加水稀釋至刻度，搖勻，室溫放置10 min；另量取水5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，同法操作得空白溶液。以空白溶液調(diào)整零點(diǎn)，在810 nm處測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中硅濃度。

2.3 檢測波長選擇

精密量取硅標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水稀釋至20 ml，加0.5 mol/L硫酸溶液5 ml，無水乙醇5 ml，搖勻，加鉬酸銨溶液5 ml，室溫放置10 min，加入混合酸溶液10 ml，抗壞血酸溶液5 ml，立即混勻，加水稀釋至刻度，搖勻，室溫放置10 min，得對照品溶液；另量取水5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，同法操作得空白溶液。以空白溶液調(diào)整基線，于400～900 nm對對照品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 硅對照品溶液吸收圖譜

由圖1可見，硅對照品溶液在810 nm處有最大吸收，因此將檢測波長定為810 nm。

2.4 顯色溶液穩(wěn)定性

精密量取硅標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水稀釋至20 ml，加0.5 mol/L硫酸溶液5 ml，無水乙醇5 ml，搖勻，加鉬酸銨溶液5 ml，室溫放置10 min，加入混合酸溶液10 ml，抗壞血酸溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，分別于顯色后不同時(shí)間于810 nm處測定溶液吸光度，結(jié)果見表1。

表1 不同顯色時(shí)間硅對照品溶液吸光度

由表1可見，加入抗壞血酸后，溶液吸光度逐漸增大，10 min后吸光度達(dá)到穩(wěn)定值，在10～60 min內(nèi)溶液吸光度穩(wěn)定性良好。

2.5 線性試驗(yàn)

精密量取硅標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分別置入100 ml聚乙烯量瓶，加水稀釋至20 ml，加0.5 mol/L硫酸溶液5 ml，無水乙醇5 ml，搖勻，加鉬酸銨溶液5 ml，室溫放置10 min，加入混合酸溶液10 ml，抗壞血酸溶液5 ml，立即混勻，加水稀釋至刻度，搖勻，室溫放置10 min，得不同濃度硅對照品溶液；另量取水5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，同法操作得空白溶液。以空白溶液調(diào)整零點(diǎn)，在810 nm處分別測定對照品溶液吸光度。以對照品溶液中Si濃度（C，μg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=1.2156C+0.0023，r=0.9999。結(jié)果表明，硅濃度在0.0988～0.484 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取硅烷化玻璃酸復(fù)合物溶液（批號20180323）6份，每份10.0 g，精密稱定，分別按2.1.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.2項(xiàng)下方法測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算硅濃度及樣品中硅含量。結(jié)果6份樣品中硅含量平均值為0.027 %（RSD=1.12 %），表明方法測定樣品的重復(fù)性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

取線性試驗(yàn)項(xiàng)下硅標(biāo)準(zhǔn)溶液5 ml顯色所得對照品溶液，于810 nm連續(xù)測定6次，結(jié)果吸光度平均值為0.601，RSD為0.13 %，表明儀器精密度良好。

由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)另一實(shí)驗(yàn)人員采用不同紫外-可見分光光度計(jì)，按2.6項(xiàng)下方法測定硅烷化玻璃酸復(fù)合物溶液（批號20180323）硅含量，平行測定6份硅含量平均值為0.026 %（RSD=1.54 %）。結(jié)果表明，不同實(shí)驗(yàn)人員采用不同儀器測定同一批次樣品樣品，所得硅含量無明顯差別，說明方法中間精密度良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取9只50 ml鎳坩堝，分別精密加入硅烷化玻璃酸復(fù)合物溶液（批號： 20180323）5.0 g，平均分為3組，第一組分別加入2.1.4項(xiàng)下硅儲備液1.2 ml，第二組分別加入2.1.4項(xiàng)下硅儲備液1.5 ml，第三組分別加入2.1.4項(xiàng)下硅儲備液1.8 ml，分別按2.1.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液并按2.2項(xiàng)下方法測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算硅濃度及硅的回收率，結(jié)果見表2。平均回收率為98.52 %（RSD=1.74 %），表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 硅回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測定

分別按2.1.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.2項(xiàng)下方法測定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算硅濃度及樣品中硅含量，結(jié)果見表3。

表3 硅烷化玻璃酸復(fù)合物硅含量測定結(jié)果

3 討論

硅標(biāo)準(zhǔn)溶液配制可采用高純二氧化硅、分析純的單晶硅或多晶硅和分析純的硅酸鈉。采用二氧化硅配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，需將二氧化硅在高溫條件下熔融，操作繁瑣，耗時(shí)長，石海強(qiáng)等[8]采用單晶硅和硅酸鈉分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定不同濃度硅標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果兩種物質(zhì)所得硅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度值線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)分別為0.989和0.981，本研究采用硅酸鈉配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，操作簡單。

硅鉬藍(lán)分光光度法測定原理是在弱酸性條件下單硅酸與鉬酸銨生成黃色的硅鉬酸絡(luò)合物，提高溶液酸度后用還原劑（抗壞血酸、硫酸亞鐵銨、硫酸亞鐵等）還原成硅鉬藍(lán)絡(luò)合物，其顏色深度與被測溶液中硅的濃度成正比[9]。本研究將硅烷化玻璃酸復(fù)合物在高溫條件下灰化，殘?jiān)?jīng)氫氧化鈉熔融處理將樣品中有機(jī)態(tài)的硅轉(zhuǎn)化成可溶的無機(jī)態(tài)的硅酸鹽，再與鉬酸銨反應(yīng)生成硅鉬酸，經(jīng)抗壞血酸還原生成硅鉬藍(lán)，從而建立了硅含量測定方法。方法學(xué)研究表明本方法準(zhǔn)確、可靠、操作簡便，具有很高的實(shí)用價(jià)值。