張治云，姜鷹雁，劉榮磊，劉亞方，陳建英

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

玻璃酸及其鹽（hyaluronan，HA）是生物體內(nèi)廣泛存在的一種酸性黏多糖，在人體中主要分布于軟骨、關(guān)節(jié)滑液、眼玻璃體和皮膚中，通常使用其鈉鹽，即玻璃酸鈉（sodium hyaluronate，SH）[1]。SH由(1→4)-D-葡糖醛酸-β-(l→3)-D-N-乙酰葡糖胺的雙糖單位重復(fù)連接構(gòu)成[2]，廣泛應(yīng)用于眼科、骨科、保健食品、化妝品等領(lǐng)域[3]。SH對(duì)皮膚具有顯著的保濕、抗衰老、營(yíng)養(yǎng)、修復(fù)等作用，且使用安全，在化妝品中的應(yīng)用日趨廣泛[4-6]。硅烷化玻璃酸復(fù)合物（silanol hyaluronate compound，SHAC）是HA的二甲基硅烷醇衍生物，實(shí)驗(yàn)研究證明其無皮膚刺激性、無細(xì)胞毒性，相比SH具有更好的保濕性能和促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖作用[7]。SHAC中有機(jī)硅含量可反映SHAC的硅烷化程度，本文采用硅鉬藍(lán)比色法測(cè)定硅烷化玻璃酸復(fù)合物中有機(jī)硅含量，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津）；Agilent 8454紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫）；XS205電子分析天平（瑞士 Mettler）；馬弗爐（魯龍 SX2-4-10，山東魯龍）。

1.2 材料

鉬酸銨（天津市大茂化學(xué)試劑廠，優(yōu)級(jí)純，批號(hào)：20141123）；抗壞血酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純，批號(hào)：20150216）；硅酸鈉（天津科密歐，優(yōu)級(jí)純，批號(hào)：20141107）；草酸（天津科密歐，分析純，批號(hào)：20150321）；濃硫酸（天津科密歐，分析純，批號(hào)：20140619）；無水乙醇（天津康科德，色譜純，批號(hào)170804）；鹽酸（國(guó)藥集團(tuán)，分析純，批號(hào)20180223）；硅烷化玻璃酸復(fù)合物（山東福瑞達(dá)生物工程公司，批號(hào)20170920，20171123，20180323）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 鉬酸銨溶液 稱取鉬酸銨四水合物5.0 g，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水適量超聲使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.1.2 混合酸溶液 稱取草酸5.0 g，置入100 ml聚乙烯量瓶，加3 mol/L的硫酸溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.1.3 抗壞血酸溶液 稱取抗壞血酸2.0 g，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.1.4 硅標(biāo)準(zhǔn)溶液 稱取硅酸鈉（Na2SiO3·9H2O）1.000 g，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為硅儲(chǔ)備液；精密量取硅儲(chǔ)備液1.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，作為硅標(biāo)準(zhǔn)溶液（含Si 9.88 μg/ml），備用。

2.1.5 樣品溶液 稱取硅烷化玻璃酸復(fù)合物溶液約10.0 g，精密稱定，置鎳坩堝中，置電爐上蒸干，殘?jiān)徛裏胱浦镣耆炕民R弗爐中于700 ℃灼燒4 h，使其充分灰化；取出，冷卻至室溫，加入氫氧化鈉4 g，蓋上坩堝蓋，置于馬弗爐中，逐漸升溫至550 ℃熔融30 min，取出冷卻至室溫，置于250 ml聚乙烯燒杯內(nèi)，加沸水適量，超聲使溶解，將浸提液轉(zhuǎn)移至500 ml聚乙烯量瓶，用沸水分?jǐn)?shù)次洗滌坩堝和坩堝蓋，洗液并入量瓶中，加鹽酸調(diào)pH至6～7，用水稀釋至刻度，搖勻。

2.2 樣品測(cè)定方法

精密量取樣品溶液5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水稀釋至20 ml，加0.5 mol/L硫酸溶液5 ml，無水乙醇5 ml，搖勻，加鉬酸銨溶液5 ml，室溫放置10 min，加入混合酸溶液10 ml，抗壞血酸溶液5 ml，立即混勻，加水稀釋至刻度，搖勻，室溫放置10 min；另量取水5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，同法操作得空白溶液。以空白溶液調(diào)整零點(diǎn)，在810 nm處測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中硅濃度。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

精密量取硅標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水稀釋至20 ml，加0.5 mol/L硫酸溶液5 ml，無水乙醇5 ml，搖勻，加鉬酸銨溶液5 ml，室溫放置10 min，加入混合酸溶液10 ml，抗壞血酸溶液5 ml，立即混勻，加水稀釋至刻度，搖勻，室溫放置10 min，得對(duì)照品溶液；另量取水5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，同法操作得空白溶液。以空白溶液調(diào)整基線，于400～900 nm對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 硅對(duì)照品溶液吸收?qǐng)D譜

由圖1可見，硅對(duì)照品溶液在810 nm處有最大吸收，因此將檢測(cè)波長(zhǎng)定為810 nm。

2.4 顯色溶液穩(wěn)定性

精密量取硅標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，加水稀釋至20 ml，加0.5 mol/L硫酸溶液5 ml，無水乙醇5 ml，搖勻，加鉬酸銨溶液5 ml，室溫放置10 min，加入混合酸溶液10 ml，抗壞血酸溶液5 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，分別于顯色后不同時(shí)間于810 nm處測(cè)定溶液吸光度，結(jié)果見表1。

表1 不同顯色時(shí)間硅對(duì)照品溶液吸光度

由表1可見，加入抗壞血酸后，溶液吸光度逐漸增大，10 min后吸光度達(dá)到穩(wěn)定值，在10～60 min內(nèi)溶液吸光度穩(wěn)定性良好。

2.5 線性試驗(yàn)

精密量取硅標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分別置入100 ml聚乙烯量瓶，加水稀釋至20 ml，加0.5 mol/L硫酸溶液5 ml，無水乙醇5 ml，搖勻，加鉬酸銨溶液5 ml，室溫放置10 min，加入混合酸溶液10 ml，抗壞血酸溶液5 ml，立即混勻，加水稀釋至刻度，搖勻，室溫放置10 min，得不同濃度硅對(duì)照品溶液；另量取水5.0 ml，置入100 ml聚乙烯量瓶，同法操作得空白溶液。以空白溶液調(diào)整零點(diǎn)，在810 nm處分別測(cè)定對(duì)照品溶液吸光度。以對(duì)照品溶液中Si濃度（C，μg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=1.2156C+0.0023，r=0.9999。結(jié)果表明，硅濃度在0.0988～0.484 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取硅烷化玻璃酸復(fù)合物溶液（批號(hào)20180323）6份，每份10.0 g，精密稱定，分別按2.1.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算硅濃度及樣品中硅含量。結(jié)果6份樣品中硅含量平均值為0.027 %（RSD=1.12 %），表明方法測(cè)定樣品的重復(fù)性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

取線性試驗(yàn)項(xiàng)下硅標(biāo)準(zhǔn)溶液5 ml顯色所得對(duì)照品溶液，于810 nm連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果吸光度平均值為0.601，RSD為0.13 %，表明儀器精密度良好。

由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)另一實(shí)驗(yàn)人員采用不同紫外-可見分光光度計(jì)，按2.6項(xiàng)下方法測(cè)定硅烷化玻璃酸復(fù)合物溶液（批號(hào)20180323）硅含量，平行測(cè)定6份硅含量平均值為0.026 %（RSD=1.54 %）。結(jié)果表明，不同實(shí)驗(yàn)人員采用不同儀器測(cè)定同一批次樣品樣品，所得硅含量無明顯差別，說明方法中間精密度良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取9只50 ml鎳坩堝，分別精密加入硅烷化玻璃酸復(fù)合物溶液（批號(hào)： 20180323）5.0 g，平均分為3組，第一組分別加入2.1.4項(xiàng)下硅儲(chǔ)備液1.2 ml，第二組分別加入2.1.4項(xiàng)下硅儲(chǔ)備液1.5 ml，第三組分別加入2.1.4項(xiàng)下硅儲(chǔ)備液1.8 ml，分別按2.1.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液并按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算硅濃度及硅的回收率，結(jié)果見表2。平均回收率為98.52 %（RSD=1.74 %），表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 硅回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

分別按2.1.5項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算硅濃度及樣品中硅含量，結(jié)果見表3。

表3 硅烷化玻璃酸復(fù)合物硅含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

硅標(biāo)準(zhǔn)溶液配制可采用高純二氧化硅、分析純的單晶硅或多晶硅和分析純的硅酸鈉。采用二氧化硅配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，需將二氧化硅在高溫條件下熔融，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，石海強(qiáng)等[8]采用單晶硅和硅酸鈉分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定不同濃度硅標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果兩種物質(zhì)所得硅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度值線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)分別為0.989和0.981，本研究采用硅酸鈉配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，操作簡(jiǎn)單。

硅鉬藍(lán)分光光度法測(cè)定原理是在弱酸性條件下單硅酸與鉬酸銨生成黃色的硅鉬酸絡(luò)合物，提高溶液酸度后用還原劑（抗壞血酸、硫酸亞鐵銨、硫酸亞鐵等）還原成硅鉬藍(lán)絡(luò)合物，其顏色深度與被測(cè)溶液中硅的濃度成正比[9]。本研究將硅烷化玻璃酸復(fù)合物在高溫條件下灰化，殘?jiān)?jīng)氫氧化鈉熔融處理將樣品中有機(jī)態(tài)的硅轉(zhuǎn)化成可溶的無機(jī)態(tài)的硅酸鹽，再與鉬酸銨反應(yīng)生成硅鉬酸，經(jīng)抗壞血酸還原生成硅鉬藍(lán)，從而建立了硅含量測(cè)定方法。方法學(xué)研究表明本方法準(zhǔn)確、可靠、操作簡(jiǎn)便，具有很高的實(shí)用價(jià)值。