柳 佳，姚慶強，鄧志鵬

（1.濟南大學 山東省醫(yī)學科學院 醫(yī)學與生命科學學院，山東 濟南250200；2.山東省醫(yī)學科學院 藥物研究所，山東 濟南250062；3.國家衛(wèi)生部生物技術藥物重點實驗室，山東 濟南250062；4.山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南250062）

桑白皮為?？浦参锷＃∕orus albaL.）的干燥根皮，是一味傳統(tǒng)中草藥，主要分布于我國安徽、河南、河北、湖南、四川、廣東等地，具有瀉肺平喘，利水消腫的功效[1]?，F(xiàn)研究表明，桑白皮具有鎮(zhèn)咳平喘[2]、抗炎[3]、降血糖[4-5]和降血脂[6]的作用。桑白皮的化學成分繁多，主要包括黃酮類化合物、芪類化合物、Diels-Alder型加合物和多糖類化合物等[7]。桑色素（morin）是從桑白皮（Mori cortex）中分離得到的黃酮類化合物[8]。近年，實驗發(fā)現(xiàn)桑色素具有抗癌、抗高尿酸血癥和消炎作用[9]，但尚未有關于桑色素的藥動學研究。本文建立了一種快速、高靈敏度、高選擇性的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（UPLC-MS/MS）測定桑色素在大鼠血漿中的濃度，并將其應用于大鼠體內(nèi)的藥動學研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Shimadzu Prominence 超高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB SCIEX Q-TRAP 5500 型質(zhì)譜儀，包括電噴霧離子源（ESI），Analyst?1.6.3數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)（美國 AB SCIEX 公司）；EVA50A型多功能樣品濃縮儀（北京普利泰科儀器公司）；Sorvall Biofuge Stratos高速冷凍離心機（賽默飛世爾）；EL204電子天平（梅特勒-托利多）；IKA Vortex天才3旋渦混勻器（廣州艾卡儀器設備公司）。

1.2 試劑

桑色素標準品（批號：HMO52276198，純度：98.87 %，寶雞辰光）；芫花素標準品（內(nèi)標物質(zhì)，純度：94.2 % ，中國食品藥品檢定研究院）；丙二醇（分析純，批號：20170901，南京威爾藥業(yè)）；甲醇（色譜純，批號：18075174，美國TEDIA公司）；乙腈（色譜純，批號：164791，賽默飛世爾）；甲酸為（色譜純級別，天津科密歐）；實驗用水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

5只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200±20 g，購自濟南朋悅動物繁育公司，許可證號為SCXK（魯）20140007。實驗期間大鼠在恒定環(huán)境下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為23±3 ℃，相對濕度為55 %±15 %，自由飲食飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 采用Thermo Hypersil GOLD-C18（50 mm×4.6 mm，3 μm）色譜柱對待測樣品和內(nèi)標化合物進行分離，流動相為0.1 % 甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序為：0～2.5 min，70 % B→90 % B；2.5～2.6 min，90 % B→7 %B；2.6～5.0 min，70 % B；流速設定為0.5 ml/min，柱溫設為40 ℃，自動進樣器溫度為15 ℃，進樣量2 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，選用負離子檢測方式，掃描方式為多反應監(jiān)測（MRM）。氣簾氣（CUR）設定為35 psi，碰撞氣設為medium，離子源噴霧電壓（IS）設為-4500 V，離子源溫度（TEM）設為 550 ℃，霧化氣壓力（Gas 1）設為 55 psi，加熱氣壓力（Gas 2）設定為55 psi。通過切換閥的切換， 每次運行僅記錄1.0～5.0 min 的MS/MS 數(shù)據(jù)。桑色素和內(nèi)標的定量離子分別為m/z300.9→151.2和m/z283.1→268.2，同時將m/z300.9→125.1作為桑色素的定性離子對。桑色素和芫花素的二級MS圖譜見圖1。

圖1 桑色素和芫花素的MS圖譜

2.2 溶液的制備

2.2.1 大鼠灌胃溶液的配制 精密稱取桑色素標準品4.41 mg，加丙二醇10 ml，超聲，然后邊渦流邊緩慢滴加10 ml水，得到桑色素單體的大鼠灌胃溶液（濃度為218.01 μg/ml）。

2.2.2 標準溶液的配制 精密稱取桑色素標準品5.10 mg，用甲醇1 ml溶解，配制成5.10 mg/ml的儲備溶液，-80 ℃貯存。臨用前先超聲，再用乙腈逐步稀釋獲得系列標準溶液后待用。精密稱取芫花素標準品2.88 mg，加入甲醇6 ml，超聲溶解，并用乙腈逐步稀釋成濃度為50 ng/ml的內(nèi)標工作溶液。

2.3 血漿樣品的處理方法

取50 μl內(nèi)標溶液，置入1.5 ml EP管,依次加入50 μl血漿樣品和100 μl乙腈，渦旋振蕩5 min，6 ℃條件下以13 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清進樣，進樣量2 μl。

2.4 方法學驗證

參照FDA[10]和中國藥典2015版的指導原則[11]，對本文建立的UPLC-MS/MS方法進行方法學驗證，包括選擇性、標準曲線、精密度和準確度、提取回收率、基質(zhì)效應和穩(wěn)定性等。

2.4.1 選擇性 分別取6份來自不同批次的大鼠空白血漿樣品、含桑色素和內(nèi)標的標準血漿樣品及給藥10 min后的大鼠血漿樣品進行 UPLC-MS/MS 分析。結(jié)果顯示，空白血漿中無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，桑色素和內(nèi)標化合物的峰形良好且互不干擾，保留時間分別為1.33，1.68 min。在高濃度樣品之后測定大鼠空白血漿樣品，其殘留不影響桑色素和內(nèi)標的含量測定。

2.4.2 標準曲線 將桑色素的儲備溶液用乙腈逐步稀釋成濃度為20.2，40.3，100.8，403.4，1008.4，4033.6，10084 ng/ml的系列對照品溶液。取對照品溶液10 μl，加入190 μl大鼠空白血漿，最終得到濃度分別為1.01，2.02，5.04，20.2，50.4，201.7，504.2 ng/ml的對照血漿樣品溶液。按2.3項方法處理上述血漿樣品后進行UPLC-MS/MS分析，連續(xù)測定3 d，記錄峰面積。以桑色素的濃度（ng/ml）作為橫坐標（x），桑色素峰面積和內(nèi)標峰面積的比值作為縱坐標（y），權重因子采用1/X2進行線性回歸分析，得到桑色素的線性回歸方程，其回歸方程為y=1.46×10-3x+2.82×10-3（r=0.9953），線性范圍為1.01～504.2 ng/ml，定量下限為1.01 ng/ml，其精密度RSD≤7.24 %，RE≤-1.19 %，滿足生物樣品測定的方法學要求。

2.4.3 精密度與準確度 將桑色素的儲備溶液用乙腈逐步稀釋，得到低、中、高濃度的質(zhì)控樣品溶液，桑色素的濃度分別為40.4，606，8068 ng/ml。取10 μl質(zhì)控樣品溶液，加入190 μl大鼠空白血漿，渦旋振蕩并離心，最終得到血漿濃度為2.02，30.3，403.4 ng/ml的質(zhì)控血漿樣品。將質(zhì)控血漿樣品按2.3項方法處理并進樣分析（每個濃度進樣5次，連續(xù)測定3 d），計算同一濃度下的精密度和準確度，得到日內(nèi)精密度RSD≤9.04%，RE≤10.06 %；連續(xù)測定3 d，其日間精密度RSD≤6.10 %，RE≤10.40 %。

2.4.4 提取回收率和基質(zhì)效應 取50 μl內(nèi)標溶液，依次加入50 μl低、中、高3個濃度的質(zhì)控血漿樣品溶液和100 μl乙腈（重復6份），按2.3項方法處理，取上清進樣分析，記錄桑色素及內(nèi)標的峰面積（Am，AIS）；另取50 μl空白血漿，加入150 μl乙腈，渦流混合5 min，13 000 r/min離心5 min，取全部上清，氮氣吹干，用 50 μl內(nèi)標溶液和50 μl桑色素溶液（濃度分別為2.02，30.3，403.4 ng/ml）對其進行復溶（重復6份），渦流混合后進行UPLCMS/MS分析，記錄桑色素及內(nèi)標的峰面積（Bm，BIS）。桑色素和內(nèi)標的回收率用峰面積之比A/B計算。桑色素的回收率為85.3 %～92.9 %，內(nèi)標的回收率為91.2 %。另取50 μl純水和150 μl乙腈，渦流混合后經(jīng)氮氣吹干，再加入50 μl內(nèi)標溶液和50 μl桑色素溶液（濃度為2.02，30.3，403.4 ng/ml），按2.3項方法處理，平行測定6份，記錄桑色素和內(nèi)標的峰面積（Cm，CIS）。分別以峰面積的比值B/C計算桑色素和內(nèi)標的基質(zhì)效應。桑色素的基質(zhì)效應為91.6 % ～ 105.9 %，內(nèi)標為103.1 %。由結(jié)果可見，大鼠血漿中的基質(zhì)對桑色素的離子作用很微弱，不影響結(jié)果的準確性，可忽略。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 桑色素分別于-80 ℃放置7 d、-80 ℃反復凍融3次、室溫放置6 h、自動進樣器（15℃）中放置12 h。按2.3項方法處理后進行UPLCMS/MS分析，平行測定3次。結(jié)果RSD≤15 %，RE≤15 %，表明桑色素在上述4種環(huán)境下均保持穩(wěn)定。

2.5 大鼠藥動學研究及結(jié)果

大鼠按2.186 mg/kg灌胃給藥，給藥前禁食12 h，自由飲水。分別在給藥后0.083，0.167，0.5，0.75，1，1.5，2，3，5，8，12，24 h于眼底靜脈叢取血約300 μl，置入肝素化的EP管，13 000 r/min離心3 min，取上層血漿,置-80 ℃保存待測。

按2.1項條件，采用UPLC-MS/MS測定大鼠血漿中桑色素的濃度，采用DAS2.1.1軟件進行擬合，得到血藥濃度-時間曲線（見圖2）和主要的藥動學參數(shù)（見表1）。大鼠灌胃給予桑色素單體后，藥-時曲線下面積（AUC0-∞）為375.8±265.7 μg/L·h，消除半衰期（t1/2z）為3.27±1.26 h，達峰時間（Tmax）為0.167±0.00 h，藥峰濃度（Cmax）為234.2±45.8 μg/L。

圖2 大鼠體內(nèi)桑色素的血藥濃度-時間曲線（n=5）

3 討論

本實驗比較了桑色素在水-甲醇、水-乙腈、0.1 % 甲酸水溶液-乙腈及含10 mmol/L乙酸銨的0.1 % 甲酸水溶液-乙腈4種流動相條件下的分離效果，流動相為0.1 % 甲酸水溶液-乙腈時桑色素和內(nèi)標的分離效果最好。通過比較桑色素在ESI下正、負兩種離子的檢測方式，發(fā)現(xiàn)桑色素在負離子模式下的響應明顯高于正離子，所以本實驗選擇在負離子檢測方式下進行。在負離子檢測模式下，對桑色素進行二級MS分析，得到桑色素的主要碎片離子為m/z300.9→151.2和m/z300.9→125.1，內(nèi)標的主要碎片離子為m/z283.1→268.2。分別將m/z300.9→151.2，m/z283.1→268.2作為桑色素和內(nèi)標的定量離子，同時采用m/z300.9→125.1對桑色素進行定性分析。在負離子條件下對桑色素和內(nèi)標的各質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果如下：桑色素的去簇電壓（DP）、射入電壓（EP）、碰撞室射出電壓（CXP）、碰撞能（CE）分別為50 V，15 V，15 V和 28 V，內(nèi)標的去簇電壓（DP）、射入電壓（EP）、碰撞室射出電壓（CXP）、碰撞能（CE）分別為65 V，15 V，50 V和32 V。

表1 桑色素的主要藥動學參數(shù)（±s，n=5）

表1 桑色素的主要藥動學參數(shù)（±s，n=5）

藥動學參數(shù)桑色素AUC0-t/μg·(L·h)-1361.2±261.7 AUC0-∞/μg·(L·h)-1375.8±265.7 MRT0-t/h2.48±1.23 MRT0-∞/h3.11±1.29 t1/2z/h3.27±1.26 Tmax/h 0.167±0.00 CL/L·(h·kg)-1 7.636±3.41 Vd/L·kg-133.0±16.5 Cmax/μg·L-1 234.2±45.8

4 結(jié)論

本實驗考察了SD大鼠灌胃給予桑色素單體后的藥動學性質(zhì)，結(jié)果表明，桑色素在大鼠體內(nèi)呈非線性動力學特征，且其在大鼠體內(nèi)吸收速度較快，大鼠灌胃給藥0.167 h即達血藥峰濃度（Cmax）。本文建立了一種測定大鼠血漿中桑色素濃度的UPLCMS/MS方法，該方法操作簡便、前處理簡單、穩(wěn)定性良好且回收率較高，可用于生物樣品中桑色素含量的測定，為桑色素的進一步研究提供幫助和支持。