歐陽(yáng)吾樂，雷福紅，楊亞晉，劉莉莉，李青青，郭愛偉*

1西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224

竹子是禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambusoideae)多年生常綠植物，全世界記載的竹子約有60屬1 200多種，廣泛分布于東南亞、印度、中國(guó)、日本和南美等地[1]。我國(guó)約有30屬300余種[2]，而云南有“竹類故鄉(xiāng)”之譽(yù)，是公認(rèn)的竹類植物的起源地和現(xiàn)代分布中心之一，有29屬220種，特有種在100種以上[3]。竹葉具有一定的藥用功效，中國(guó)古代許多藥典都記載了竹子的藥用價(jià)值，在《中華本草》中收錄了紫竹(Phyllostachysnigra)、淡竹 (Phyllostachysglauca)、苦竹(Pleioblastusamarus)、毛竹(Phyllostachysheterocycla)、慈竹(Neosinocalamusaffinis)、刺竹(BambusablumeanaSchult.f)和桂竹(Phyllostachysbambusoides)等竹，竹葉具有清熱除煩、消痰、止咳、健脾、生津利尿等功效，主治熱病、煩渴、小兒驚癇、舌瘡等[4]。近年來竹子植物化學(xué)方面的研究表明，竹葉中含有許多天然活性成分如黃酮類、生物堿、有機(jī)酸、萜類、酚類、蒽醌、鞣質(zhì)、皂甙、多糖等化合物[5]，其中黃酮類化合物是竹葉中重要的活性物質(zhì)，竹葉中黃酮含量較高的有麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)為2.02%，毛金竹(Phyllostachysnigra)為1.98%，毛竹為1.70%，高節(jié)竹(Phyllostachysprominens)為1.55%，較低的有四季竹(Oligostachyumlubricum)(1.18%)和苦竹(1.35%)等[6]。黃酮類化合物由于其結(jié)構(gòu)中酚羥基內(nèi)鄰位酚羥基極易被氧化，因此對(duì)活性氧和活性氮等自由基具有很強(qiáng)的捕捉能力，其具有較強(qiáng)的抗氧化功效[7,8]。

我國(guó)約有竹林面積 500多萬hm2，以每0.07 hm2產(chǎn)200 kg 鮮葉計(jì)算，若能利用其中1%用于天然抗氧化劑的開發(fā)，每年就可以提供14萬t原料，具有廣闊的開發(fā)前景[1]。本研究以西南林業(yè)大學(xué)竹園中的4種竹為研究對(duì)象，對(duì)其竹葉進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分和黃酮分析，并提取了4種竹葉的黃酮提取物，在體外研究了4種竹葉黃酮提取物的抗氧化活性，為竹類資源中天然活性產(chǎn)物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，對(duì)竹葉的綜合利用具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 竹葉采集及制備

研究所用竹子來源于西南林業(yè)大學(xué)竹園，采集莿竹屬的觀音竹(Bambusamultiplex)，剛竹屬的金竹(Phyllostachyssulphurea)和紫竹(Phyllostachysnigra)，慈竹屬的孖竹(Neosinocalamusrecto-cuneatus)，采集每種竹的上、中、下三個(gè)部位葉子各500 g左右，將新鮮樣品滅活(120 ℃烘箱，10～15 min)后在實(shí)驗(yàn)室陰干、粉碎，然后將每種竹葉的上、中、下三個(gè)部位的竹葉混勻，放置于-20 ℃儲(chǔ)藏備用[9]。

1.2 儀器與試劑

RV8 S96旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA)，SG8200HPT超聲波清洗器(上海冠特)， M6纖維測(cè)定儀(丹麥福斯)，KJELTEC-2300全自動(dòng)蛋白測(cè)定儀(丹麥福斯)，SZF-06A脂肪測(cè)定儀(上海新嘉)，TU-1901紫外可見分光光度計(jì)(北京普析)。所用試劑均為分析純。

1.3 竹葉營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

竹葉營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定參考Zhang[10]的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》中的方法和步驟，用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白(crude protein,CP)，索氏抽提法測(cè)定粗脂肪(ether extract,EE)，高溫灼燒法測(cè)定粗灰分(Ash)，粗纖維(crude fiber,CF)采用酸堿洗滌法測(cè)定，高錳酸鉀法測(cè)定鈣(calcium,Ca)，鉬黃比色法測(cè)定總磷(total phosphorus,TP)，無氮浸出物(nitrogen free extract,NFE)采用差值計(jì)算法計(jì)算[10]。

1.4 竹葉黃酮的提取及黃酮含量測(cè)定

竹葉黃酮提取方法參照Wang等的[11]方法，稱取1 g竹葉粉置于250 mL錐形瓶，與15 mL 70%乙醇充分混勻放入超聲波清洗器，在功率設(shè)30 W，提取25 min，提取3次，合并提取液抽濾，離心(4 ℃、8 000 rpm、10 min)，收集上清液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮 (45±1)℃至浸膏狀備用。以蘆丁為對(duì)照品，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定總黃酮含量[11]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y= 1.338x+ 0.000 4，R2= 0.999，Y為吸光度(Abs)，x為標(biāo)樣濃度 (mg/mL)，說明蘆丁濃度C(mg/mL)與吸光度Abs之間具有良好的線性關(guān)系。

1.5 竹葉黃酮提取物的體外抗氧化研究

1.5.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH自由基清除能力測(cè)定參照Z(yǔ)hang等[12]方法進(jìn)行，準(zhǔn)確稱取30.90 mg DPPH溶于250 mL棕色容量瓶中，用純水將竹葉黃酮提取物稀釋成質(zhì)量濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL，取1 mL不同濃度的竹葉黃酮提取物與1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液于5 mL離心管中，搖勻后立即置于黑暗中反應(yīng)1 h。用無水乙醇校零，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光值為Abs樣本。重復(fù)以上操作，將樣本換成無水乙醇并測(cè)定吸光值為Abs空白，用BHT(二丁基羥基甲苯)作陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。DPPH自由基清除率計(jì)算如下:

SCDPPH(%) = (1-Abs樣本/Abs空白) × 100%

1.5.2 ABTS自由基清除方法

ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)方法參照Li等[13]的方法進(jìn)行，竹葉黃酮提取物用純水稀釋成質(zhì)量濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL溶液，取0.4 mL不同濃度的竹葉黃酮提取物與4 mL ABTS工作液混合后用旋渦混勻器振搖12 s，靜置300 s后用95%乙醇校零，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光值并記作Abs樣本，然后將樣本換成95%乙醇重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn)步驟，測(cè)得吸光值記作Abs空白，以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

SCABTS(%) = (Abs空白- Abs樣本) /Abs空白×100%

1.5.3 金屬螯合能力的測(cè)定

金屬螯合能力(metal-ion chelating activity)參照Wang等[14]的方法進(jìn)行，用純水將竹葉黃酮提取物稀釋成質(zhì)量濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL，取0.5 mL不同濃度的竹葉黃酮提取物，依次加入1.8 mL甲醇、0.05 mL 2 mmol四水氯化亞鐵、0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪，混合均勻避光反應(yīng)10 min，甲醇校零，在波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定樣品的吸光值為Abs樣本，空白對(duì)照吸光值記作Abs空白，以乙二胺四乙酸(EDTA)作陽(yáng)性對(duì)照。金屬螯合能力計(jì)算公式如下：

金屬螯合能力 (%) = (1-Abs樣本/Abs空白) × 100%

1.5.4 亞鐵還原能力測(cè)定

亞鐵還原能力(ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)測(cè)定參照Muller等[15]的方法進(jìn)行。用純水將竹葉黃酮提取物稀釋成質(zhì)量濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mg/mL、0.50 mg/mL，將0.5 mL 竹葉黃酮提取物和1 mL的FRAP工作液混合，定容至10 mL，所得藍(lán)色溶液在室溫靜置20 min，測(cè)定593 nm處的吸光值，結(jié)果記為A593，1 mL FRAP試劑用雙蒸水定容至10 mL并測(cè)定吸光值作為空白，以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

竹葉中營(yíng)養(yǎng)成分用干物質(zhì)(dry matter)表示，每份樣品均進(jìn)行3次平行測(cè)定，取3次測(cè)定值的平均值作為該指標(biāo)測(cè)定的結(jié)果。數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P< 0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種竹葉營(yíng)養(yǎng)成分和總黃酮分析

竹葉營(yíng)養(yǎng)成分和黃酮的分析表明(表1)，4種竹葉的CP差異顯著(P<0.05)，孖竹葉CP最高(20.74±0.45)%，觀音竹CP最低(14.21±0.35)%；從EE來看，觀音竹 EE最高(2.92±0.08)%，孖竹EE最低(1.65±0.10)%，EE孖竹與觀音竹、紫竹、金竹間差異顯著(P<0.05)；4種竹葉中金竹Ash最高(13.6±0.45)%，孖竹最低(7.00±0.23)%；觀音竹、紫竹、金竹、孖竹間的Ash差異顯著(P<0.05)；CF觀音竹最高(28.77± 0.34)%，孖竹(22.19±0.40)% 最低，金竹和紫竹的CF無顯著性差異(P>0.05)；4種竹葉中NFE孖竹最高，觀音竹、紫竹、金竹無顯著差異(P>0.05)；4種竹葉中Ca差異顯著(P<0.05)，金竹Ca最高，觀音竹最低；4種竹葉TP在(0.12±0.01)% ～(0.15±0.02)%，無顯著性差異(P>0.05)；觀音竹中黃酮含量最高(1.90±0.25)%，其次為紫竹(1.43±0.12)%，金竹最低(0.37±0.02)%。

表1 4種竹子竹葉營(yíng)養(yǎng)成分與黃酮分析(%)

注：同列中相同英文字母表示差異性不顯著(P> 0.05)，不同英文字母表示差異性顯著(P< 0.05)。

Note:The same letters in the same column mean no significant difference (P> 0.05),and different letters indicate significant difference (P< 0.05).

2.2 4種竹葉黃酮提取物的體外抗氧化研究

2.2.1 DPPH自由基清除能力

4種竹葉黃酮提取物對(duì)DPPH自由基清除的分析可以看出(圖1)，隨著竹葉黃酮提取物濃度的升高，4種竹葉黃酮提取物和BHT清除DPPH自由基能力也隨之增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.15 mg/mL時(shí)，觀音竹黃酮提取物(BMLFE)、紫竹黃酮提取物(PNLFE)、孖竹黃酮提取物(NRLFE)、金竹黃酮提取物(PSLFE)和BHT對(duì)DPPH自由基的清除率分別為98.00%、80.88%、71.85%、97.87%及93.60%。總體上來看，4種竹葉中PSLFE清除DPPH自由基的效果最好，BMLFE清除DPPH自由基的效果與BHT接近。

圖1 4種竹葉黃酮提取物對(duì)DPPH自由基清除Fig.1 DPPH radical scavenging ability of flavonoid extracts from four bamboo leaves注：BMLFE為觀音竹黃酮提取物;PNLFE為紫竹黃酮提取物;NRLFE為孖竹黃酮提取物;PSLFE為金竹黃酮提取物;BHT為二丁基羥基甲苯。下同。Note:The BMLFE is flavonoid extracts from Bambusa multiplex leaves;The PNLFE is flavonoid extracts from Phyllostachys nigra leaves;The NRLFE is flavonoid extracts from Neosinocalamus recto-cuneatus leaves;The PSLFE is flavonoid extracts from Phyllostachys sulphurea leaves;BHT is butylated hydroxytoluene.The same as below.

2.2.2 ABTS自由基清除能力

竹葉黃酮提取物對(duì)ABTS自由基清除能力的分析可以看出(圖2)，隨著黃酮濃度的升高，竹葉黃酮提取物和BHT清除ABTS自由基能力也隨之增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.15 mg/mL時(shí)，BMLFE、PNLFE、NRLFE、PSLFE和BHT對(duì)ABTS自由基的清除率分別為53.18%、52.76%、80.37%、74.11%及90.10%。總體上來看，對(duì)ABTS自由基的清除能力大小順序依次為BHT > NRLFE > PSLFE > PNLFE > BMLFE，4種竹葉中NRLFE和PSLFE清除ABTS自由基的效果與BHT接近，PNLFE和BMLFE清除效果較差。

圖2 4種竹葉黃酮提取物的ABTS自由基清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging ability of flavonoid extracts from four bamboo leaves

2.2.3 亞鐵還原能力

亞鐵還原能力的分析可以看出(見圖3)，隨著4種竹葉提取物和BHT濃度的增加亞鐵還原能力也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，BMLFE、PNLFE、NRLFE、PSLFE和BHT的吸光值分別為0.50、0.49、0.45、0.53和0.25?？傮w上看，4種竹葉黃酮提取物的亞鐵還原能力均比BHT強(qiáng)，4種竹葉中PSLFE亞鐵還原能力最強(qiáng)，NRLFE最弱。

圖3 4種竹葉黃酮提取物的亞鐵還原能力Fig.3 The power of ferric reducing antioxidant of flavonoid extracts from four bamboo leaves

2.2.4 金屬螯合能力

一些金屬離子在脂質(zhì)的氧化過程中起催化作用，并誘導(dǎo)自由基和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，因此具有金屬螯合作用的天然產(chǎn)物能間接地起到抗氧化作用。金屬螯合能力的分析可以看出(見圖4)，4種竹葉提取物和EDTA的金屬螯合能力隨黃酮濃度的升高而增強(qiáng)，但竹葉黃酮提取物金屬螯合能力明顯弱于EDTA。在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，PSLFE與NRLFE金屬螯合能力較強(qiáng)，BMLFE最弱。

圖4 4種竹葉黃酮提取物的金屬螯合能力Fig.4 The metal-ion chelating activity of flavonoid extracts from four bamboo leaves

2.3 4種竹葉黃酮提取物的IC50

IC50值可作為評(píng)價(jià)抗氧化劑清除自由基能力的指標(biāo)，4種竹葉黃酮提取物的IC50可以看出(圖5)，PSLFE清除自由基50%時(shí)所需的黃酮濃度最低，其清除DPPH自由基效果優(yōu)于BHT，其它依次為BHT、BMLFE、NRLFE和PNLFE；當(dāng)ABTS自由基清除率達(dá)到50%時(shí)，BHT濃度最低，依次為NRLFE、PSLFE、PNLFE和BMLFE?？傮w上看，與BHT相比，4種竹葉黃酮提取物中PSLFE和NRLFE抗氧化效果較好。

圖5 4種竹葉提取物的IC50分析Fig.5 IC50 of four bamboo leaves

2.4 竹葉中黃酮含量與抗氧化相關(guān)性分析

竹葉黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性差異較大，由表2可知，竹葉中黃酮含量與ABTS自由基清除顯著的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)在為0.72(P<0.05)，而竹葉中黃酮含量與DPPH自由基清除和FRAP無顯著相關(guān)(P>0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為0.30和0.76。

表2 竹葉中黃酮含量與抗氧化相關(guān)性分析

3 結(jié)論

許多研究表明，竹葉含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和黃酮，陸志科和謝碧霞研究了9種竹葉的營(yíng)養(yǎng)成分，結(jié)果表明，粗蛋白質(zhì)在10.24%～16.68%，總糖含量14.35%～24.61%，水溶性糖含量7.86%～11.45%，總黃酮含量1.18% ～ 2.02%，多糖6.49%～14.55%[6]。Jiang等[9]研究的10種竹的營(yíng)養(yǎng)成分表明，其粗蛋白在11.64%±0.70%～19.54%±2.76%，粗脂肪1.91%±0.76%～3.59%±0.32%，竹葉粗纖維在37.58%±2.45%～43.29%±4.10%，鈣在0.85%±0.05%～0.93%±0.07%，總磷在0.15%±0.01%～0.27%±0.03%，粗灰分在12.06%±4.32%～16.16%±3.80%。研究表明竹葉中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和黃酮，尤其是蛋白質(zhì)、鈣、黃酮等，且不同竹種間營(yíng)養(yǎng)成分和黃酮存在差異。

目前，人類食品和動(dòng)物飼料中廣泛添加人工合成的抗氧化劑來提高食品的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，所用的抗氧劑大多數(shù)是人工合成的，如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)、叔丁基對(duì)二酚(TBHQ)等，許多動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，人工合成的抗氧化劑對(duì)人和動(dòng)物機(jī)體有一定的毒害作用，甚至有些會(huì)致癌、致畸[16]，所以人工合成抗氧化劑的安全性引起了人們的擔(dān)憂。而對(duì)來源于植物中的天然抗氧化劑的興趣越來越高，尤其是富含黃酮類的植物。研究表明，竹葉含有較高的黃酮，具有很強(qiáng)的清除活性氧自由基和羥自由基的能力。DPPH自由基的清除是一種廣泛用于評(píng)價(jià)植物來源粗提取物或純化物質(zhì)清除自由基的常用模型，F(xiàn)RAP和ABTS自由基清除能力經(jīng)常用于快速評(píng)估谷物和蔬菜中各種抗氧化劑的總抗氧化能力。本研究采用FRAP法來反映竹葉黃酮提取物對(duì)鐵離子的還原能力，用DPPH和ABTS來評(píng)價(jià)竹葉黃酮提取物對(duì)自由基的清除能力，較全面反映了4種竹葉的抗氧化功效，結(jié)果表明，金竹黃酮提取物和孖竹黃酮提取物在體外具有較強(qiáng)的抗氧化性。

植物活性成分的抗氧化能力與總黃酮含量間的關(guān)系還存在一些爭(zhēng)議，許多研究表明，植物中總黃酮含量與抗氧化性存在顯著的相關(guān)性，即黃酮含量越多其抗氧化性越強(qiáng)，Xu等[17]比較了華南地區(qū)5個(gè)主要品種番石榴(Psidiumguajava)的總抗氧化能力與黃酮間的關(guān)系，結(jié)果表明，番石榴的總抗氧化能力與黃酮含量之間具有顯著的相關(guān)性(P< 0.05)。Bai等[18]研究了啤酒花(Humuluslupulus)廢棄枝葉多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析，結(jié)果表明啤酒花主枝、側(cè)枝和葉子多酚、黃酮與抗氧化具有顯著的相關(guān)性。但也有研究表明，黃酮含量與抗氧化活性無相關(guān)性，尚紅梅等研究表明，菊苣根的抗氧化活性與其中的黃酮含量關(guān)系不大，僅ABTS自由基清除能力與黃酮含量顯著正相關(guān)，而與總酚含量有很大關(guān)系[19]，這與本研究結(jié)果一致，本研究表明，竹葉中黃酮含量與ABTS自由基清除顯著的正相關(guān)性，與DPPH自由基清除和FRAP無顯著相關(guān)。存在這種差異的原因可能是與植物中黃酮結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性有關(guān)，黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物，迄今為止，有9 000多種不同的結(jié)構(gòu)黃酮類化合物被發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有多羥基、雙鍵、芳香環(huán)等特殊結(jié)構(gòu)，具有抗氧化、清除自由基等作用[20]，但不同的黃酮類化合物由于其結(jié)構(gòu)上的差異表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的抗氧化，今后應(yīng)從植物黃酮粗提取物中分離、純化黃酮，研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗氧化活性及穩(wěn)定性關(guān)系，為人工合成高效的植物源性抗氧化劑提供指導(dǎo)。