馬建蘋/王 丹/李善家/郭 濤 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730050

馬建蘋/王 丹/郭 濤 甘肅省中藏藥篩選評價(jià)及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州理工大學(xué)，蘭州730050

晉 玲 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州730000

藿香(Agastache rugosa)為唇形科(Labiatie)藿香屬(Agastache)一年生或多年生草本植物，全草可入藥，有止嘔吐、治霍亂腹痛、驅(qū)逐腸胃充氣、清暑等效；果可作香料；葉及莖均富含揮發(fā)性芳香油，有濃郁的香味，為芳香油原料[1]。藿香揮發(fā)油中的主要成分甲基胡椒酚也能夠?qū)Χ喾N病原菌產(chǎn)生抑制作用[2]。隨著植物內(nèi)生真菌被人們重視，其次級代謝產(chǎn)物中許多具有抗菌活性的單體化合物被報(bào)道[3]。植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的物質(zhì)，因此希望從藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物獲得具有抗菌活性的物質(zhì)代替化學(xué)合成的抗菌劑。但國內(nèi)外鮮有藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物抗菌活性的報(bào)道。鑒于藿香及其內(nèi)生真菌的重要價(jià)值，本研究希望對藿香內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性研究，篩選出能產(chǎn)生抗菌活性次級代謝產(chǎn)物的菌株，為具有抗菌活性的單體化合物的分離提供活性指導(dǎo)，同時為藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1.材料及儀器

1.1 材料與儀器

植物采集于甘肅省蘭州市石佛溝，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為藿香Agastache rugosa。紫外分光光度計(jì)、電子分析天平、電熱恒溫干燥箱、超凈工作臺、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、實(shí)驗(yàn)型高壓滅菌鍋等均為常用儀器；實(shí)驗(yàn)所用藥品試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 供試菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均由蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)：取去皮馬鈴薯200g，加適量水煮沸30min，8層紗布過濾，加入葡萄糖20g，定容至1000mL，121℃滅菌30 min，待冷卻后分別加入100U/mL的青霉素和硫酸鏈霉素各1mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200g，煮沸30min，8層紗布過濾，加入葡萄糖20g，定容至1000mL，然后加入1.5 % ～ 2 %瓊脂，121℃滅菌30 min，待冷卻至50℃左右時，加入100U/mL的青霉素和硫酸鏈霉素各1mL。

MH肉湯：蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，牛肉膏0.3%，加蒸餾水并加熱使其充分溶解后，用1M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2 ～ 7.4，放入高壓滅菌鍋內(nèi)，101 kPa，121℃滅菌30 min，放入4℃冰箱，備用。

2.2 內(nèi)生真菌的分離與鑒定

組織分離法：取干燥洗凈的藿香花，用解剖刀將其切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小塊。在無菌條件下先后用75 % (V/V)乙醇(1 min)、0.1 %升汞(2 min)消毒，消毒后用無菌水反復(fù)沖洗3次，用已滅菌的濾紙吸干水分。用已滅菌的鑷子將組織塊接入到PDA培養(yǎng)基上，以最后1次表面消毒沖洗后的無菌水作為參照，28℃恒溫培養(yǎng)7 d。待內(nèi)生真菌長出后，觀察菌落形態(tài)特征，重復(fù)劃線純化[4]。采用插片法：將已純化的內(nèi)生真菌接種到PDA平板上，將已滅菌的蓋玻片斜插入平板中，28℃培養(yǎng)，生長完全后放于載玻片上經(jīng)過棉蘭染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、孢子和分生孢子梗等形態(tài)。根據(jù)《真菌鑒定手冊》初步鑒定[5]。對次級代謝產(chǎn)物具有良好抗菌活性的菌株H-2與H-9進(jìn)行測序后，將序列在NCBI中BLAST分析對比得出菌株H-2黑孢霉屬(Niqrospora sp.)真菌，其登錄號為MK894846，菌株H-9為鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌，其登錄號為MK880492。

2.3 內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)及供試樣品的制備

挑取已活化的菌株接種于PDB培養(yǎng)液中，28℃、120r/min培養(yǎng)7d，發(fā)酵結(jié)束后，抽濾，得到濾液與菌絲體。在濾液中先后加入等體積的乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，各萃取3次，合并萃取液，減壓蒸干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯和正丁醇部位；菌絲體冷凍干燥后用乙醇回流提取2～3h，提取液減壓蒸干得菌絲體的乙醇部位；發(fā)酵液減壓蒸干得到發(fā)酵液的水部位。

2.4 MlC值測定

精確稱量待測樣品6.0 mg，加入150 μL的DMSO充分溶解，再加入1350μL的MH肉湯，將樣品濃度稀釋為2000，1000，500，250，125μg/mL，備用。在96孔平底微孔板中依次加入100μL的MH肉湯，50μL梯度稀釋的樣品溶液，50μL 0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木?，使待測樣品的終濃度分別為1000，500，250，125，62.5，31.25μg/mL[ - ]。 陰性對照組為50μL1% DMSO的MH肉湯，陽性對照為50μL含50 μg/mL硫酸鏈霉素的MH肉湯。37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12-18 h，然后每孔加入50 μL 100μg/mL INT（碘硝基四唑紫）顯色劑，30min后觀察顏色變化，以沒有顯示紅色的最低濃度作為該樣品對某一細(xì)菌的最小抑制濃度(MIC)。

3.結(jié)果

3.1 內(nèi)生真菌的分離和初步鑒定

從藿香的花中共分離出13株內(nèi)生真菌，根據(jù)其顯微形態(tài)特征鑒定出其中菌株H-1為絲核菌屬(Agonomyaetcssp.)，菌株H-3為長蠕孢菌屬(Helminthosporium sp.)，菌株H-4、H-12及H-8為短蠕孢菌屬(Brachysporium sp.)，菌株H-5、H-6和H-7為絲孢菌屬(Hyphomycetessp.)、菌株H-9為鏈格孢菌屬(Alternariasp.)、菌株H-11為鐮刀菌屬(Fusarium sp.)，菌株H-13為頭孢霉屬(Trichosporeaesp.)，菌株H-10未鑒定出結(jié)果。

3.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物各部位抗菌活性

本實(shí)驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法對藿香花中內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性測定，陽性對照硫酸鏈霉素在50 μg/mL時對所有供試菌都有抑制活性，陰性對照組樣品均顯紅色，表明抑菌試驗(yàn)?zāi)Ｐ土己?，有抑菌活性的樣品結(jié)果見表1，菌株H-2的乙酸乙酯部位抑菌活性最好，對6種供試細(xì)菌的MIC值均為250μg/mL；菌株H-9的乙酸乙酯部位對無乳鏈球菌的抑制作用很強(qiáng)，在31.25 μg/mL具有抑制作用，對其他供試細(xì)菌在500 μg/mL也具有抑制作用。次級代謝產(chǎn)物的正丁醇部位抑菌活性較好的為H-2、H-5、H-6和H-9，均能夠在最大濃度1000 μg/mL時對這六種供試細(xì)菌表現(xiàn)出抑制作用，菌株H-4的正丁醇部位在濃度為1000 μg/mL時除了對金黃色葡萄球菌無抑制活性，對其他5種供試細(xì)菌均能夠產(chǎn)生抑制作用。H-2的菌絲體的乙醇提取物在最大濃度1000 μg/mL對這六種供試細(xì)菌表現(xiàn)出抑制作用。13株內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物的水部位在最大濃度1000 μg/mL時對這六種供試細(xì)菌都沒有表現(xiàn)出抑制作用。綜上所述，藿香花中內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯部位與正丁醇部位對六種供試菌具有抑制作用，且乙酸乙酯部位的抑制作用較強(qiáng)。

表1 藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的最低抑菌濃度(MlC,μg/mL)

4.討論

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，藿香中內(nèi)生真菌的種類與其次級代謝產(chǎn)物的生物活性的研究還未見報(bào)道，而與藿香同科不同屬的植物廣藿香的中的內(nèi)生真菌被大量研究。廣藿香中的優(yōu)勢菌株為擬莖點(diǎn)霉屬、鐮刀菌屬等，同時也發(fā)現(xiàn)有彎孢屬、黑孢霉屬及曲霉屬真菌的存在?？梢园l(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬、黑孢霉屬真菌是兩種植物共同所都有的內(nèi)生真菌。目前，我國常用的抑菌效果的評估方法主要是牛津杯法與濾紙片法，通過抑菌圈的大小來判斷抑菌效果的強(qiáng)弱，此類方法難以進(jìn)行大量樣品的活性篩選，且抑菌物質(zhì)的濃度低時可能無抑菌圈[ ]。因此，具有簡便性和良好的方法學(xué)性能的微量肉湯稀釋法測定MIC值，更適合檢測大量樣品的抗菌活性及臨床藥敏性試驗(yàn)。目前，國內(nèi)外微量肉湯稀釋法僅用于臨床藥敏試驗(yàn)與植物化學(xué)成分的抗菌活性的測定，而對植物內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的體外抗菌活性測定沒有在相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道。采用微量肉湯稀釋法可以快速準(zhǔn)確篩選出具有良好抗菌活性次級代謝產(chǎn)物的極性部位，從而為后續(xù)具有抗菌活性的單體化合物的分離純化提供活性導(dǎo)向。藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗菌活性還未被報(bào)道出來，本實(shí)驗(yàn)通過測定藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的體外抗菌活性，篩選出能夠產(chǎn)生良好抗菌活性次級代謝產(chǎn)物的菌株，為利用發(fā)酵技術(shù)從藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物中生產(chǎn)抗菌劑及甘肅本地產(chǎn)藿香的開發(fā)利用提供了理論指導(dǎo)。