劉 蕾，楊 勇，高 欣，劉曉雷，唐 斌，王學(xué)林，劉明遠(yuǎn)，白 雪

近年來，旋毛蟲的基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組和蛋白質(zhì)組的研究為深入了解旋毛蟲生物學(xué)、旋毛蟲-宿主相互作用和發(fā)病機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)的分子基礎(chǔ)[1-2]。然而，對于旋毛蟲蛋白質(zhì)生物合成過程中或之后發(fā)生的轉(zhuǎn)錄后修飾(Post Transcriptional Modification, PTMs)至今沒有相關(guān)報(bào)到，限制了旋毛蟲侵襲過程中關(guān)鍵蛋白分子的功能研究。PTMs可以調(diào)控蛋白質(zhì)的性質(zhì)，包括折疊、穩(wěn)定性、定位、結(jié)合親和力和活性，它們在多種細(xì)胞途徑和過程中發(fā)揮重要作用。由于它們在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能及代謝和基因轉(zhuǎn)錄等細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此，蛋白質(zhì)PTMs的研究在后基因組時代變得更加重要[3]。迄今為止，已經(jīng)鑒定了超過461種不同的PTM，例如磷酸化、甲基化、泛素化、丙二酰化、琥珀酰化、糖基化和乙?；?，其在許多原核和真核蛋白質(zhì)的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[4]。這些PTM形成一個復(fù)雜的監(jiān)管系統(tǒng)，用于在各種條件下細(xì)胞的動態(tài)調(diào)控。

研究表明，乙酰化可以調(diào)節(jié)寄生蟲的發(fā)育和抗原變異，這主要是由強(qiáng)選擇壓力決定的[5]。旋毛蟲的完整生命周期發(fā)生在單一宿主體內(nèi)，可分為3個主要階段：肌幼蟲期(ML)，成蟲期(AD)和新生幼蟲期(NBL)。它們占據(jù)了2個不同的細(xì)胞內(nèi)龕：腸細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞[6]。在這些發(fā)育階段，旋毛蟲已進(jìn)化出適應(yīng)不同環(huán)境并成功建立感染(例如寄生蟲表面抗原的變異)的策略。因此，旋毛蟲不同發(fā)育階段的乙?；鞍踪|(zhì)組的研究，有助于揭示賴氨酸乙?；谡{(diào)節(jié)旋毛蟲發(fā)育轉(zhuǎn)變及其在不同生活環(huán)境的選擇壓力下成功寄生中的作用。本研究第一次大規(guī)模分析旋毛蟲肌幼蟲期蛋白質(zhì)中賴氨酸乙?；潭?，不僅可以拓展我們對蠕蟲蛋白乙?；闹R，而且為設(shè)計(jì)新的控制旋毛蟲病的疫苗及藥物靶點(diǎn)提供了重要信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動物與旋毛蟲蟲種 Wistar大鼠，購自長春生物制品研究所，用于旋毛蟲傳代保種及旋毛蟲肌幼蟲收集。中國河南豬旋毛蟲分離株T.spiralis(ISS534)，由本室傳代保種。

1.1.2主要試劑 胃蛋白酶、胰蛋白酶、三氟乙酸購自Sigma公司；三氯乙酸(TCA)、碘乙酰胺(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)購自Merck公司；蛋白酶抑制劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司；2-D Quant試劑盒購自GE Healthcare公司；EDTA購自索萊寶公司；抗乙酰賴氨酸抗體珠購自PTM Biolabs公司；C18 ZipTips購自美國Millipore公司。

1.2 方 法

1.2.1旋毛蟲收集和蛋白質(zhì)提取 旋毛蟲(ISS534)在Wistar大鼠中通過連續(xù)傳代保種。取旋毛蟲ISS534感染后35 d(dpi)的Wistar大鼠1只，脫頸致死，37 °C人工消化液(10 g/L胃蛋白酶和10 mL/L濃鹽酸)消化胴體2 h后，采用自然沉淀的方法收集感染性肌幼蟲(ML)隨后進(jìn)行蟲體蛋白的提取。用含有8 mol/L尿素，10 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)和0.1%蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液裂解旋毛蟲后，進(jìn)行超聲處理，并通過20 000×g、4 ℃離心10 min除去細(xì)胞碎片。離心后的上清液用預(yù)冷的15%三氯乙酸(TCA)在-20 ℃沉淀2 h后離心。沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌3次，隨后溶解在含有8 mol/L尿素和100 mmol/L NH4CO3(pH 8.0)的緩沖液中，2-D Quant試劑盒(GE Healthcare)測量蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2樣品制備和高效液相色譜(HPLC)分離肽段

用10 mmol/L DTT和20 mmol/L碘乙酰胺(IAA)對蛋白進(jìn)行還原和烷基化處理，并用胰蛋白酶(1∶50質(zhì)量比)過夜消化。為確保完全消化，以1∶100(質(zhì)量比)再次消化4 h。隨后使用高pH反相HPLC將胰蛋白酶肽分成6個部分并將分離的肽在Speed Vac(Thermo Scientific)中干燥，保存在-80 ℃，用于乙?；患治?。

1.2.3親和富集和液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)分析 將分級分離的肽溶解在含有100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCl和0.5% NP-40(pH8.0)的NETN緩沖液中，并在4 ℃下與抗乙酰賴氨酸抗體珠(PTM Biolabs)孵育過夜。用NETN緩沖液和去離子H2O洗滌后，0.1%三氟乙酸洗脫肽段，真空干燥。在HPLC/MS/MS 分析前用C18 ZipTips(Millipore)清理洗脫的肽段。隨后，利用EASY-nLC 1000超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)上在Q Exactive 質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific)對所富集的肽段進(jìn)行LC-ESI-MS/MS分析，所得到的MS/MS數(shù)據(jù)使用MaxQuant軟件和整合的Andromeda搜索引擎(v.1.5)進(jìn)行處理。使用以下參數(shù)在UniProt上的T.spiralis數(shù)據(jù)庫對串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行查詢[7]：胰酶酶解肽段在譜圖搜庫時使用最大4個漏切位點(diǎn)，每個肽段最大4個修飾個數(shù)。Mass error 設(shè)置為母離子10-6，碎片離子0.02 Da。指定Cys上的氨甲酰甲基化為固定修飾，指定Met上的氧化，Lys上的乙?；偷鞍踪|(zhì)N-末端上的乙?；癁榭勺冃揎棥５鞍?、肽段和乙?；腇DR閾值設(shè)置為1%, 最小肽段長度為7。

1.2.4生物信息學(xué)分析 利用UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫對鑒定的蛋白進(jìn)行GO(gene ontology)功能注釋。利用Wolfpsort對每個乙?；牡鞍走M(jìn)行亞細(xì)胞定位注釋。在對目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行GO注釋或KEGG通路注釋的富集分析時，通過Fisher精確檢驗(yàn)(Fisher’s Exact Test)，來分析乙酰化蛋白GO或KEGG通路蛋白質(zhì)富集度的顯著性水平，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1旋毛蟲賴氨酸乙酰化蛋白的鑒定與分析 分析表明分子量偏差的分布接近零，大部分≤10-6(圖1A)。此外，所有賴氨酸乙?；牡拈L度都在7到37個氨基酸之間，這與胰蛋白酶消化的肽一致(圖1B)。這些結(jié)果表明樣品制備方法是正確的，并且從MS獲得的修飾的肽數(shù)據(jù)是高度準(zhǔn)確的。本實(shí)驗(yàn)共鑒定出1 592個乙?；鞍准? 872個Kac位點(diǎn)，旋毛蟲的乙酰化蛋白含有不同數(shù)目的乙?；稽c(diǎn)，范圍從1至47(圖1C)，約一半(795/1 592)僅含有一個乙?；稽c(diǎn)，平均每個蛋白2.4個位點(diǎn)。

(A)所有鑒定的肽的質(zhì)量誤差分布；(B)乙?；牡拈L度分布；(C)乙酰化修飾蛋白修飾位點(diǎn)的分布圖1 組學(xué)基于的旋毛蟲賴氨酸乙?；稽c(diǎn)的鑒定 Fig.1 Proteome-wide identification of lysine acetylation sites in T. spiralis

2.2旋毛蟲賴氨酸乙?；?Kac)保守性分析 在旋毛蟲的1 592個乙?；鞍字?，408個(35.5%)和87個(30%)的蛋白分別與日本血吸蟲和弓形蟲乙酰化蛋白存在同源物，479個(35.2%)和471個(36.3%)的蛋白分別與小鼠和人類乙?；鞍状嬖谕次?。159個(31.6%)和190個(39.8%)蛋白分別與釀酒酵母和白色念珠菌存在同源物，而僅43個(12.3%)與大腸桿菌乙?；鞍状嬖谕次?圖2)。

圖2 分析比較旋毛蟲乙酰蛋白質(zhì)組與大腸桿菌，芽殖酵母(釀酒酵母)，白色念珠菌，剛地弓形蟲，日本血吸蟲，小鼠和人類的乙?；鞍踪|(zhì)組 Fig.2 Analysis comparing the T. spiralis acetyl proteome with those of E. coli, budding yeast (S. cerevisiae), C. albicans, T. gondii, S. japonicum, mouse, and human. Venn diagram describing the relationships among lysine-acetylated proteins from these species.

2.3乙酰化蛋白質(zhì)在旋毛蟲中的功能注釋和細(xì)胞定位 我們對乙?；牡鞍踪|(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了基因本體(gene ontology，GO)分析。細(xì)胞組件聚類分析顯示旋毛蟲乙?；鞍踪|(zhì)主要分布在細(xì)胞(37%)，細(xì)胞器(24%)，大分子復(fù)合物(22%)和膜(13%)中。分子功能的聚類分析顯示，最大一組乙?；鞍讌⑴c各種靶標(biāo)結(jié)合，占所有鑒定乙酰化蛋白質(zhì)的40%(圖3B)。本文的結(jié)果與以前的研究結(jié)果一致，其中相當(dāng)數(shù)量的具有催化活性的蛋白被乙?；?。GO生物過程的聚類分析顯示乙酰化蛋白主要參與細(xì)胞和代謝過程，分別占識別蛋白的29%和28%(圖3C)。本文也分析了1 592個乙?；鞍踪|(zhì)在旋毛蟲中的亞細(xì)胞定位(圖3D)，結(jié)果表明大多數(shù)鑒定的Kac蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)(38%)，其次是細(xì)胞核(17%)和線粒體(12%)。這一結(jié)果與生物過程分析結(jié)果一致，表明大部分乙?；鞍踪|(zhì)參與細(xì)胞代謝和蛋白質(zhì)合成。重要的是，還發(fā)現(xiàn)一些乙?；鞍踪|(zhì)是細(xì)胞質(zhì)膜(12%)或細(xì)胞外蛋白質(zhì)(12%)定位，其可能調(diào)節(jié)旋毛蟲表面蛋白和分泌蛋白，影響旋毛蟲與宿主細(xì)胞之間的相互作用。

2.4功能富集分析 進(jìn)一步對乙?；瘮?shù)據(jù)進(jìn)行了GO富集分析?；谏镞^程的GO富集分析顯示，乙?；鞍踪|(zhì)富集于生物合成和代謝過程(圖4A)。同時還進(jìn)行了KEGG富集分析，數(shù)據(jù)表明，旋毛蟲(T.spiralis)的乙?；鞍踪|(zhì)組在蛋白質(zhì)生物合成和3種類型的生物大分子的代謝中高度富集(圖4B)。

(A)根據(jù)細(xì)胞成分分類的乙?；鞍踪|(zhì)；(B)根據(jù)生物學(xué)過程分類的乙?；鞍踪|(zhì)；(C)根據(jù)分子功能分類的乙?；鞍踪|(zhì)；(D)鑒定的乙?；鞍椎膩喖?xì)胞定位。圖3 基因本體功能分類和亞細(xì)胞定位信息鑒定乙?；鞍踪|(zhì)Fig.3 Gene Ontology functional classification and subcellular location information of identified acetylated proteins

(A)就分子功能，細(xì)胞組分和生物過程而言，乙?；鞍踪|(zhì)的基于GO的富集分析；(B)KEGG途徑富集分析。圖4 旋毛蟲乙?；鞍椎母患治?Fig.4 Enrichment analysis of acetylated proteins in T. spiralis

3 討 論

賴氨酸乙酰化(Kac)是一種動態(tài)可逆且高度保守的翻譯后修飾，是乙?；D(zhuǎn)移酶 (lysineacetyltransferase, KAT) 和去乙酰化酶 (lysine deacetylase, KDAC)催化乙酰輔酶A(acetyl-CoA)提供的乙?；鶊F(tuán)到蛋白質(zhì)分子賴氨酸殘基的可逆轉(zhuǎn)移過程。Kac首先在真核組蛋白中被鑒定，它參與調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA轉(zhuǎn)錄[7]。除了在組蛋白中的作用外，Kac還存在于許多非核蛋白中參與不同的細(xì)胞生理過程，如細(xì)胞骨架動力學(xué)、凋亡、自噬和代謝[8]。另外，乙酰化也影響病原菌的毒力和抗生素抗性[9]。盡管Kac在許多生物體中發(fā)揮重要作用，但是迄今為止，蠕蟲賴氨酸乙?；难芯肯鄬τ邢蕖Ｐx作為重要的寄生蠕蟲，其基因組的測序揭示了許多乙酰轉(zhuǎn)移酶和脫乙酰酶同源物的存在，表明Kac可能在旋毛蟲的發(fā)育和代謝中發(fā)揮重要作用[10]。Kac過程依賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙酰酶(KDAC)調(diào)節(jié)，比其他PTMs的調(diào)控范圍廣泛并且更有可比性。KDAC已被確定為開發(fā)新型抗寄生蟲治療的藥物靶點(diǎn)，并且一些KDAC配體顯示出治療寄生蟲病的潛力[11]。

本項(xiàng)究中，我們利用抗賴氨酸乙?；贵w富集技術(shù)結(jié)合高度靈敏的質(zhì)譜鑒定在組學(xué)層面分析旋毛蟲中的賴氨酸乙?；潭?，發(fā)現(xiàn)旋毛蟲1 592種蛋白質(zhì)872個賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生了乙?；揎?，超過了已報(bào)道的日本血吸蟲中Kac水平[12]，表明Kac在旋毛蟲發(fā)育、寄生中的重要作用。與以前的研究結(jié)果一致，大量的乙?；鞍踪|(zhì)涉及代謝和生物合成過程。進(jìn)一步分析表面，大約一半的乙酰化蛋白存在2個以上的修飾位點(diǎn)。乙酰化轉(zhuǎn)移酶通過修飾非組蛋白的多重位點(diǎn)利用不同的機(jī)制調(diào)節(jié)從細(xì)胞信號、蛋白轉(zhuǎn)錄、降解等不同的細(xì)胞進(jìn)程[13]。這是旋毛蟲蛋白的多重位點(diǎn)乙?；揎椩谡{(diào)節(jié)蛋白功能中的作用需要進(jìn)一步的研究。大量的證據(jù)表明，乙酰化修飾可能是進(jìn)化保守在不同的種屬[14]。

我們對乙?；牡鞍走M(jìn)行了保守性分析，結(jié)果表明旋毛蟲和大腸桿菌之間的同源性最低，這可能反應(yīng)了真核與原核生物間不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生物進(jìn)程。而旋毛蟲和白色念珠菌之間的同源性最高，這可能與它們之間的遺傳性相關(guān)，也可能他們有著相似的亞細(xì)胞分布。在其他真核生物和原核生物中也報(bào)道了乙?；鞍踪|(zhì)在各種途徑(包括翻譯，轉(zhuǎn)錄和代謝)中高度富集，我們的GO和KEGG富集結(jié)果進(jìn)一步表明了Kac在各種生物體中的重要作用。乙?；揎椩谔谴x已被表面發(fā)揮著重要的作用在調(diào)節(jié)寄生蟲生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)在瘧原蟲糖酵解相關(guān)酶中僅僅葡萄糖六磷酸異構(gòu)酶(GAPDH)沒有發(fā)生乙?；痆15]，而在血吸蟲中，全部的糖酵解發(fā)生了乙?；揎?。我們的研究發(fā)現(xiàn)，僅僅GAPDH沒有發(fā)生乙?；揎?。結(jié)果表明與其他寄生蟲一樣，乙?；揎椩谛x糖代謝調(diào)節(jié)中同樣發(fā)揮著重要的作用。已表明吞噬在寄生蟲獲取營養(yǎng)，細(xì)胞增殖和寄生蟲毒力中發(fā)揮重要的作用。有趣的是，根據(jù)功能富集分析，29個乙?；鞍着c吞噬作用相關(guān)，表明賴氨酸乙?；谶@一過程中的重要作用[16]?？傊狙芯渴状螌πx乙?；膱?bào)道，提供了旋毛蟲乙?；瘓D譜，為進(jìn)一步探索賴氨酸乙?；谌湎x的寄生作用提供了重要數(shù)據(jù)。

利益沖突：無