蘇雅靜，喬 霞，劉學雷，楊寧愛，賈 偉,2，趙志軍,2

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii，T.gondii)于1908年由Nicolle等[1]發(fā)現(xiàn)，是一種寄生于真核細胞內(nèi)的頂復門原蟲，可在人和動物體內(nèi)建立持久的感染[2]。最近研究顯示，AIDS合并弓形蟲病的情況愈發(fā)嚴峻，以撒哈拉以南的非洲地區(qū)最為顯著，AIDS合并弓形蟲感染可占AIDS感染的87.1%[3-4]。弓形蟲除了會造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染外，亦可造成其他器官的感染，尤其是肺，但目前關于肺弓形蟲病的報道較少[5]。

弓形蟲在侵入宿主細胞、增殖及致病過程中，棒狀體蛋白 (Rhoptry, ROP)等效應分子起到重要作用，其可在多點操縱宿主的抵抗機制、調(diào)節(jié)促炎反應，并對宿主基因表達和信號通路進行廣泛的修飾[4]。ROP16屬于ROP2家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可直接定位于宿主細胞核，并參與宿主細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)相關的磷酸化。ROP16Ⅰ可調(diào)節(jié)宿主基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達。研究發(fā)現(xiàn)，ROP16Ⅰ/Ⅲ可激活并維持STAT3/6的激活反應，而ROP16Ⅱ則無此功能。此外，在感染早期ROP16Ⅰ/Ⅲ可誘導宿主巨噬細胞向M2型極化，Th2 大量表達能夠促使ariginase I 酶活性升高，L-arginine 代謝途徑向著生成大量多胺類物質(zhì)進行，促使弓形蟲急性感染或復發(fā)感染[6-7]。但目前關于ROP16Ⅰ所調(diào)控的宿主基因和分子仍不完全清楚，因此從基因水平研究ROP16Ⅰ對弓形蟲病的防治具有重要意義。本研究擬構(gòu)建ROP16Ⅰ真核重組表達載體，通過對ROP16Ⅰ基因轉(zhuǎn)染A549細胞株后的差異表達基因進行篩選，并聯(lián)合生物信息學工具和數(shù)據(jù)庫進行分析，從基因和分子水平探討ROP16Ⅰ的致病機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 大腸桿菌DH5α、真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1及弓形蟲RH株為本實驗室保存；Trizol(Invitrogen公司，美國)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒均購自大連Takala公司；TransLipid Transfection Reagent、Taq DNA聚合酶、T4連接酶均購自北京全式金公司；EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；A549人肺腺癌細胞購自上海細胞庫；細胞培養(yǎng)相關試劑購自Gibco公司；ICR小鼠購自寧夏醫(yī)科大學動物中心；基因芯片檢測由上?？党缮镉邢薰就瓿?。

1.2 方 法

1.2.1弓形蟲速殖子總RNA的提取 從液氮罐取出RH蟲株，復蘇后腹腔接種ICR小鼠。觀察小鼠狀態(tài)，出現(xiàn)背毛逆立、閉目及腹部膨大等典型癥狀時，折頸處死，收集腹水。傳代3次后，抽取腹水，800 g離心去掉上清，PBS重懸后2000 g離心，收集沉淀即為RH蟲株。采用 Trizol法提取總RNA，Nano Drop 2000測定總RNA的純度和濃度。

1.2.2構(gòu)建ROP16Ⅰ基因真核表達載體 根據(jù)GeneBank中ROP16Ⅰ基因全長編碼序列設計引物，引物兩端同時包含EcoR-Ⅰ，Sal-Ⅰ酶切位點，上游序列：5′-CCGGAATTCTGATGAAAGTGACCACGAAAGGG-3′，下游序列：5′- ACGGTCGACCATCCGATGTGAAGAAAGTTC-3′。建立40 μL PCR反應體系，退火溫度為55 ℃。將PCR產(chǎn)物雙酶切，回收目的片段。將其連接至真核表達載體pEGFP-N1上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞后提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定并測序[8]。

1.2.3數(shù)據(jù)處理與差異基因篩選 應用Agilent Feature Extraction軟件對表達譜結(jié)果進行處理，提取原始數(shù)據(jù)。而后，采用GeneSpring軟件對原始數(shù)據(jù)進行Quantile標準化和隨后的處理。差異表達基因(differential expression gene, DEG)通過Fold Change篩選，標準為差異倍數(shù)Fold change(FC)≥ 2.0，負值表示下調(diào)。

1.2.4文獻挖掘已知候選基因 Genecards是一個收集并展示人類基因及其產(chǎn)物和相關疾病等綜合信息的知識平臺[9]，本研究以“Toxoplasma”作為搜索詞，進入Genecards(http://www.genecards.org/)搜索已知弓形蟲疾病基因，也采用OMIM(http://omim.org/)在線工具搜索弓形蟲疾病相關基因。

1.2.5ToppGene篩選候選基因 ToppGene(https://toppgene.cchmc.org/)是一個基于GO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫、BIOCYC數(shù)據(jù)庫及REACTOME 信號通路等數(shù)據(jù)庫的基因列表功能富集分析的一站式門戶網(wǎng)站[10]。將Genecards及OMIM兩個數(shù)據(jù)庫搜索到的共有基因作為“Training Gene Set”，而以所獲得的差異表達基因作為“Test gene set”，利用ToppGene進行候選基因的篩選，并對差異表達基因進行GO 分析及KEGG分析。

1.2.6蛋白互作網(wǎng)絡 STRING(https://string-db.org/)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫，主要通過高通量實驗數(shù)據(jù)、共表達數(shù)據(jù)、基因組上的關聯(lián)及之前文獻的累積挖掘整合收錄了已知蛋白間和預測蛋白質(zhì)間的相互作用關系[2]。將得到的差異表達基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，通過在線分析差異表達基因所編碼的蛋白間的相互作用圖，找出處在關鍵節(jié)點的蛋白質(zhì)。而后，將ToppGene篩選得到的弓形蟲疾病候選基因也上傳至STRING在線工具，繪制出相應的蛋白互作網(wǎng)絡圖。

2 結(jié) 果

2.1差異表達基因的篩選 經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)，ROP16Ⅰ基因轉(zhuǎn)染A549細胞后差異性表達的基因共有483個，其中表達上調(diào)的基因有252個，表達下調(diào)的基因有231個，上調(diào)和下調(diào)幅度最大的前10個基因見表1。在上調(diào)表達的差異基因分布中，BC015119表達量最大(32.71)，其次是 LOC646999(16.83)；而在下調(diào)表達的差異基因分布中，OR51G2(-117.86)下調(diào)幅度最大。

2.2Genecards和OMIM挖掘已知弓形蟲疾病相關基因 在Genecards中搜索已知“Toxoplasma” 疾病基因，共獲得191條gene card記錄；通過OMIM查詢獲得39條疾病相關基因。對這兩種方法獲得的基因進行交集分析，共獲得已知弓形蟲疾病相關基因9個，見表2。

2.3篩選Ι型弓形蟲疾病候選基因 采用ToppGene候選基因篩選策略，對候選基因進行優(yōu)化排序，表3顯示的是篩選出的前30個Ι型弓形蟲疾病候選基因。通過對ToppGene和ToppNet獲得的候選基因進行交集分析，發(fā)現(xiàn)共有14個基因同時被篩出。

表1 FC值(上調(diào)/下調(diào))表達量最大的部分基因
Tab.1 Representative list of(up-regulated/down-regulated)genes

RankUp regulated gene SymbolFCRankDown regulated gene SymbolFC1BC01511932.711OR51G2-117.862LOC64699916.832RGS3-6.913LOC1001298908.223APCDD1-5.524CMPK27.754DIO3-5.335FGF56.805LIPG-4.906OAS26.096C18orf26-4.787BATF25.927C1orf180-4.698OASL5.908OR51F2-4.489IFIT25.899GIMAP1-4.4110IFIT35.7710SCARNA4-4.26

表2 通過Genecards和OMIM獲得的已知弓形蟲疾病相關基因
Tab.2 Toxoplasma related genes using Genecards and OMIM

RankSymbolGene ID1STAT667782MYD8846153CCR112304TNF71245IL435656IL12B35937CXCL1036278ALOX52409IDO13620

表3 前30個ToppGene篩選的Ι型弓形蟲疾病候選基因
Tab.3 Top 30 candidate genes of ToppGene forT.gondiitype Ι

ToppGeneToppNetRankGene symbolAverage score(×10-1)Overall P-value(×10-3)RankGene symbolInteractant countScore(×10-4)1STAT110.0001.6171CXCR3520.3502TLR39.9972.4362CCL54113.3703IFIH19.9573.3073STAT11949.7084DDX589.9713.8084CCL899.5195STAT29.6203.8565ESR17668.8466HLA-B9.8544.0456CXCL1146.8927IFNB110.0004.4507HDAC53564.2718CCL59.9985.2828AMOT1014.0799CXCR39.9955.6469NMI693.804表3(續(xù))ToppGeneToppNetRankGene symbolAverage score(×10-1)Overall P-value(×10-3)RankGene symbolInteractant countScore(×10-4)10FLT39.3086.19710PML2493.70711TREX19.5246.62511IFI163573.65012FGFR18.8637.51512IRF7483.43213CXCL119.9617.54513STAT2493.36614EIF2AK29.9687.54514TLR3323.18515CASP19.9527.54515LMO22083.15916IL229.9457.66916HTT2553.09817OAS19.6018.31617PARP14132.88618FGFR28.3178.35118CD93352.65319ESR18.3089.94919BST2122.40320IRF77.4989.95520ISG152142.27221CCL89.71111.28021PIAS11312.19422ANGPT28.24411.60022PCDH7401.87923TNFSF109.46612.05023FGFR11041.55524TAP17.82912.36024FGFR2921.43425TAP27.82812.36025EIF2AK21061.41526IFNA169.98914.45026RGS3581.27127OSMR9.16715.10027PLSCR11371.24328OAS29.51916.48028LAMP3641.03529BMP78.69116.57029IFIT3690.99930PIAS19.64917.33030HLA-B780.990

2.4GO功能聚類分析 利用ToppGene對差異表達基因進行GO分析。發(fā)現(xiàn)，ToppGene共獲得95條有統(tǒng)計學意義的生物學過程，其中MF(Molecular Function，MF)有37條，BP(Biological Process，BP)有50條，CC(Cellular Component，CC)有8條。GO 富集結(jié)果主要表現(xiàn)在BP和MF兩大類。表4顯示的是前10條GO功能注釋，主要富集在免疫應答、炎癥反應、防御反應、免疫系統(tǒng)進程、白細胞游走控制、趨化因子合成調(diào)節(jié)和細胞因子產(chǎn)生的調(diào)控等方面(表4)。

表4 前10條差異表達基因的GO功能注釋
Tab. 4 Top 10 enriched GO terms for DEGs

RankCategoryGO IDGO nameGene numberP(×10-9)1BPGO:0006954inflammatory response80.3782BPGO:0002684positive regulation of immune system process80.4753BPGO:0032103positive regulation of response to external stimulus62.2924BPGO:0050777negative regulation of immune response52.7495BPGO:0002685regulation of leukocyte migration58.7036BPGO:0045080positive regulation of chemokine biosynthetic process39.3507BPGO:0001819positive regulation of cytokine production69.7908BPGO:0002683negative regulation of immune system process610.0709BPGO:0034097response to cytokine710.88010BPGO:0002682regulation of immune system process815.020

2.5KEGG通路分析 利用ToppGene對差異表達基因進行KEGG分析，共獲得50條有統(tǒng)計學意義的信號通路，表5顯示的是前10條信號通路。主要涉及白介素IL-10, IL-4, IL-13信號通路，細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、細胞因子網(wǎng)絡及Toll樣受體信號通路等(表5)。

表5 前10條富集的信號通路
Tab. 5 Top 10 enriched KEGG pathways for DEGs

RankIDPathway namenumberGene nameP(×10-11)11269318Signaling by Interleukins8ALOX5,TNF,MYD88,IL12B,STAT6,CXCL10,IL4,CCR19.01721470924Interleukin-10 signaling5TNF,IL12B,CXCL10,IL4,CCR19.53431269310Cytokine Signaling in Immune system8ALOX5,TNF,MYD88,IL12B,STAT6,CXCL10,IL4,CCR1163.7004194384African trypanosomiasis4TNF,IDO1,MYD88,IL12B652.80051470923Interleukin-4 and 13 signaling5ALOX5,TNF,IL12B,STAT6,IL4721.2006842771Inflammatory bowel disease 4TNF,IL12B,STAT6,IL48360.0007144181Leishmaniasis4TNF,MYD88,IL12B,IL413400.0008M17406Cytokine Network3TNF,IL12B,IL434520.000983051Cytokine-cytokine receptor in-teraction5TNF,IL12B,CXCL10,IL4,CCR154250.0001083076Toll-like receptor signaling pathway4TNF,MYD88,IL12B,CXCL1056070.000

2.6蛋白互作網(wǎng)絡 通過STRING 在線分析工具對差異表達基因進行蛋白互作分析，結(jié)果如圖1所示。發(fā)現(xiàn)， STAT1、STAT2、HLA-B、CXCR3、CCL5、TLR3 等存在于蛋白相互作用網(wǎng)絡的中心節(jié)點，刪除這些關鍵節(jié)點后，蛋白互作網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)渙散。而有趣的是，ToppGene 所篩選得到的14個候選基因所調(diào)控的蛋白恰好處于網(wǎng)絡的中心節(jié)點處。隨后我們將這14個候選基因也上傳至STRING 在線工具，繪制出相應的蛋白互作圖，結(jié)果如圖2所示。

圖2 Toppgene 篩選的候選基因蛋白互作圖Fig. 2 PPI network of the candidate genes screened from the ToppGene

3 討 論

弓形蟲入侵宿主細胞過程復雜，蟲體蛋白和宿主蛋白等多種因子相互作用并參與該過程。ROP16是弓形蟲入侵過程中的重要毒力因子，可參與宿主細胞內(nèi) STAT3/6 相關的磷酸化，并抑制宿主細胞IL-12的生成，干擾宿主細胞的增殖、分化和凋亡等功能[11-12]，這是弓形蟲發(fā)揮其致病性的一個重要途徑。Saeij等[13]研究發(fā)現(xiàn)，I 型弓形蟲入侵宿主細胞后可誘導 STAT3/6 發(fā)生強烈的磷酸化，而 II 型蟲株則無此能力。Butcher等[14]研究也發(fā)現(xiàn)弓形蟲基因型是決定 STAT 信號通路能否被激活的重要因素。ROP16I感染小鼠巨噬細胞后能夠持續(xù)誘導 STAT3 的活化，并驅(qū)動巨噬細胞向 M2 極化，同時抑制IL-12生成。而 ROP16II蟲株則不能持續(xù)激活STAT3的磷酸化，但可導致下游IL-12的大量合成。目前關于弓形蟲 ROP16I入核后的具體分子機制仍不清楚，涉及多個基因、多條通路的相互作用和相互影響。

圖1 差異表達基因蛋白互作圖Fig.1 PPI network of the screened DEGs

生物信息學在表達譜的基礎上能夠多層次的了解基因表達情況，對基因功能富集分析、通路富集分析及網(wǎng)絡調(diào)控分析的探討具有重要作用[15]。本研究運用 ToppGene 在線分析工具，篩選了Ι 型弓形蟲疾病候選基因；同時利用 STRING 分析工具構(gòu)建了ROP16I分子調(diào)控網(wǎng)絡。發(fā)現(xiàn)弓形蟲 ROP16Ⅰ在人肺腺癌A549細胞過表達后，共有483個基因表達差異顯著，其中上調(diào)基因252個，下調(diào)基因231個。在上調(diào)表達差異的基因分布中，BC015119表達量最大，其次是LOC646999；而在下調(diào)表達差異的基因分布中，OR51G2變化量最大，下調(diào)倍數(shù)達-117.86。LOC646999屬Akirin1 家族，而 Akirins 是天然免疫反應信號通路所必需的核內(nèi)因子。研究發(fā)現(xiàn)，Akirin 在NF-κB 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用，而 NF-κB 與發(fā)育、免疫應答及細胞增生和細胞凋亡等多種生物過程密切相關[16]。OR51G2 是嗅覺受體家族中的一員，參與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白介導的氣味信號轉(zhuǎn)導途徑，從而引發(fā)對氣味的感知。而BC015119屬于未知基因，在轉(zhuǎn)染ROP16I基因后BC015119上調(diào)顯著，其生物學功能有待進一步研究。

弓形蟲感染宿主后通過復雜的細胞因子網(wǎng)絡進行免疫調(diào)節(jié)[17]。本研究通過 ToppGene 生物信息學工具最終篩選得到CXCR3、CCL5、STAT1、CCL8、ESR1、CXCL11、IRF7、STAT2、TLR3、PIAS1、FGFR1、FGFR2、EIF2AK2及HLA-B 等14個 Ι 型弓形蟲相關的疾病候選基因。GO 分析和 KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，這些候選基因與白介素IL-10、IL-4、IL-13信號通路，細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、細胞因子網(wǎng)絡及Toll 樣受體信號通路相關。在蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡中，我們發(fā)現(xiàn)這14個候選基因恰好處于網(wǎng)絡的最核心位置。目前，關于CCL8、CXCL11、PIAS1及EIF2AK2 在弓形蟲疾病方面的研究報道很少。CCL8 作為趨化因子的一員，在機體炎癥反應和免疫應答等方面發(fā)揮重要作用。有研究顯示，寄生蟲感染可引起CCL8表達的增加，CCL8 與 CXCL12通過協(xié)調(diào)發(fā)揮免疫抑制作用，導致持續(xù)感染。通過降低 CCL8水平，能夠顯著抑制疾病的發(fā)生發(fā)展[18-19]。CXCL11正常情況下表達量較少。CXCL11-CXCR3是免疫炎癥反應的一個重要環(huán)節(jié)，參與炎癥、感染等多種生理病理的發(fā)生發(fā)展。CXCL11與受體CXCR3 結(jié)合后可促進下游一系列促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α等的表達，從而抑制病原體的增殖和擴散。但目前關于CXCL11相關信號通路的研究則較少[20]。PIAS1是STAT1特異性抑制子，具有小泛素樣修飾劑SUMO-E3鏈激酶的活性，參與多種轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)控和多種蛋白質(zhì)的SUMO化修飾。另外，PIAS1 也可以作為抗炎因子負調(diào)控NF-κB/STAT1信號通路，從而抑制炎癥損傷[21]。EIF2AK2 是由IFN誘導產(chǎn)生，在IFN抗病毒通路中扮演著重要的角色。EIF2AK2 又被稱為蛋白激酶R(PKR)。PKR 最初是以非活性狀態(tài)存在的，但在ds RNA或5′端磷酸化的 ss RNA等病原體RNA出現(xiàn)后，作為一種應答反應，PKR通過自磷的方式被激活，接下來PKR磷酸化 EIF2AK2 的51位絲氨酸，抑制其翻譯的起始，進而阻止病原體復制[22]。這些基因可能是Ι型弓形蟲感染過程中的重要靶點，可作為今后研究的關鍵分子。但由于本研究采用的是腫瘤細胞而非原代細胞，有些通路不一定反應體內(nèi)真實的細胞事件，而且僅限于對弓形蟲肺炎的機制解釋。

綜上，轉(zhuǎn)染ROP16Ⅰ基因后影響宿主細胞基因表達譜，CCL8、CXCL11、PIAS1及EIF2AK2 等候選基因的發(fā)現(xiàn)為進一步研究Ι型弓形蟲疾病的致病機理提供了新的思路，但目前其具體的作用機制仍不清楚，文獻也未見報道。關于這些候選基因在弓形蟲疾病發(fā)生發(fā)展中的作用仍需進一步證實。

利益沖突：無