王艷華，KHAN MUZ，許 笑，蔡建平

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種革蘭氏陽性厭氧芽胞桿菌，廣泛存在于自然界，尤其是在土壤、人類和動物的腸道中廣泛存在。它可以感染人和各種動物(主要為牛、羊等)，造成人類食物中毒，引起動物壞死性腸炎、腸毒血癥以及創(chuàng)傷性氣性壞疽等疾病。這些病不僅嚴(yán)重威脅著人類和動物的健康，而且給社會造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。最近，依據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的主要毒素和致病性的不同，將其修訂為7個(gè)型(A至G型，見表1)[4]。在所有類型的產(chǎn)氣莢膜梭菌中α-毒素(CPA)都是最保守的，其基因位于染色體上，編碼β-、ε-、ι-、CPE和NetB毒素的基因位于質(zhì)粒上[5]，A型菌株被認(rèn)為是人類最易感染的病原體[6]。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型
Tab.1C.perfringenstoxin-based typing scheme

Toxinotype(toxin gene)a-toxin (plc or cpa) β-toxin(cpb) ε-toxin(etx)i-toxin(iap and ibp)CPE(cpe)NetB(netB)A+-----B+++---C++--+/--D+-+-+/--E+--++/--F+---+/--G+----+

注：+為indicates production of that toxin；- 為indicates no production of that toxin.

20世紀(jì)80年代以來，人們對產(chǎn)氣莢膜梭菌的多種酶、毒素基因及其產(chǎn)物的功能以及它們與宿主的相互作用進(jìn)行了深入研究。這些毒素和酶具有特定的活性，通常毒素和酶協(xié)同作用，從而使其在致宿主組織病變過程中發(fā)揮重要作用[7-9]。20世紀(jì)70年代，有人提出產(chǎn)氣莢膜梭菌中存在調(diào)節(jié)毒素產(chǎn)生的特定機(jī)制[7,10]。之后，研究人員報(bào)道了一種小信號分子參與穿孔溶血素O產(chǎn)生的調(diào)節(jié)[11-12]。1994年產(chǎn)氣莢膜梭菌雙組分VirS/VirR調(diào)節(jié)系統(tǒng)得以鑒定，并認(rèn)為毒素的產(chǎn)生受該系統(tǒng)嚴(yán)格調(diào)控[13-14]，例如，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌僅在芽胞形成過程中產(chǎn)生腸毒素(CPE)。此后，發(fā)現(xiàn)許多毒素基因受VirS/VirR雙組分調(diào)控系統(tǒng)和輔助基因調(diào)節(jié)因子(agr)群體感應(yīng)(QS)系統(tǒng)的調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)幾種雙組分系統(tǒng)和RNA調(diào)節(jié)因子形成一個(gè)緊密的網(wǎng)絡(luò)對毒素的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)控[9]。因此，產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素產(chǎn)生和調(diào)控機(jī)制研究成為人們了解和闡明該病原菌致病性的一個(gè)最重要的方面。產(chǎn)氣莢膜梭菌的幾個(gè)雙組分調(diào)控系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛分析，本文主要就VirS/VirR系統(tǒng)對產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述，以期能為今后該菌致病機(jī)理研究和抗菌藥物的開發(fā)奠定新的起點(diǎn)。

1 雙組分調(diào)控系統(tǒng)組成

雙組分系統(tǒng)是細(xì)菌最關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，可以感知環(huán)境并將信息傳輸至細(xì)胞中[15]。一個(gè)典型的雙組分系統(tǒng)通常由位于膜的傳感器組氨酸激酶和充當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞質(zhì)反應(yīng)調(diào)節(jié)子組成[16]。組氨酸激酶是細(xì)菌感應(yīng)各種環(huán)境變化必需的，通常是由2個(gè)單體組成的同源二聚體膜蛋白，每個(gè)單體含有1個(gè)可變的傳感器結(jié)構(gòu)域(sensor domain) 和1個(gè)保守的傳遞器結(jié)構(gòu)域(transmitter domain)，2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域通過1個(gè)α-螺旋相連。其傳感器結(jié)構(gòu)域能感應(yīng)環(huán)境變化，并將信號傳遞到細(xì)胞質(zhì)傳遞器催化結(jié)構(gòu)區(qū)域。反應(yīng)調(diào)節(jié)子控制輸出信息，反應(yīng)調(diào)節(jié)子是雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的第2個(gè)組分，含有1個(gè)或多個(gè)保守的 N 端接受器結(jié)構(gòu)域(receiver domain) 和可變的 C 端效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域 (effector domain)。組氨酸激酶的傳感器結(jié)構(gòu)區(qū)域能夠檢測到體內(nèi)外刺激，調(diào)控組氨酸激酶的活性。組氨酸激酶催化 ATP 依賴的特定的組氨酸自主磷酸化，然后反應(yīng)調(diào)控蛋白催化組氨酸的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到它自身的天門冬氨酸殘基上，反應(yīng)調(diào)控蛋白的磷酸化激活效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，從而產(chǎn)生一系列調(diào)控反應(yīng)[17]。目前研究表明許多雙組分系統(tǒng)含有額外的調(diào)節(jié)伴侶蛋白[18]。雙組分系統(tǒng)信號的終止需通過反應(yīng)調(diào)節(jié)子去磷酸化完成，在大多情況下，反應(yīng)調(diào)節(jié)子的去磷酸化需要通過另一種蛋白-輔助磷酸酶的催化。雙組分調(diào)節(jié)控系統(tǒng)可調(diào)節(jié)細(xì)菌的多種代謝過程、細(xì)菌細(xì)胞周期、細(xì)菌間的信號交流和細(xì)菌毒力因子的表達(dá)[19]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌VirS/VirR系統(tǒng)中的virR和virS基因位于操縱子中，被轉(zhuǎn)錄為單個(gè)的2.1 Kb mRNA[20]。VirR/VirS系統(tǒng)是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要和最有特點(diǎn)的1個(gè)雙組分系統(tǒng)。VirS/VirR系統(tǒng)由傳感器組氨酸激酶virS基因和反應(yīng)調(diào)節(jié)因子virR基因組成。virS基因產(chǎn)物VirS在N末端具有6個(gè)假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。C末端結(jié)構(gòu)域包含傳感器組氨酸激酶中常見4個(gè)基序中的3個(gè)。這些基序包括His-255殘基是其它傳感器激酶中自磷酸化位點(diǎn)[14]。virR的N-末端結(jié)構(gòu)域含有保守的天冬氨酸殘基，其接受來自同源傳感器組氨酸激酶的磷酸基團(tuán)[13-14]。

2 雙組分調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制

2.1VirS/VirR系統(tǒng)對毒素的調(diào)控 VirR/VirS系統(tǒng)最早于1994年被鑒定為α-毒素基因plc，κ-毒素基因colA和θ-毒素基因pfoA的調(diào)節(jié)因子[13,20]。Northern分析顯示，3種毒素基因plc，pfoA和colA在轉(zhuǎn)錄水平受到VirR/VirS的正調(diào)控。VirS/VirR系統(tǒng)調(diào)節(jié)3種毒素基因的模式不同。pfoA基因具有2個(gè)啟動子，主要和次要啟動子，其中只有主要啟動子依賴于VirR/VirS。colA基因含有7個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，其中2個(gè)依賴于VirR/VirS。plc基因僅具有1個(gè)啟動子，其由VirR/VirS部分調(diào)節(jié)[20]。由于在3種毒素基因的啟動子區(qū)域中未發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)構(gòu)，因此表明VirR/VirS系統(tǒng)不直接調(diào)節(jié)所有這些毒素基因的表達(dá)，并且在VirR/VirS調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中存在更復(fù)雜的系統(tǒng)，可能涉及其他二級調(diào)節(jié)因子[20]。

之后研究發(fā)現(xiàn)，VR-RNA就是上述調(diào)控系統(tǒng)的1個(gè)二級調(diào)節(jié)因子。通過VR-RNA，VirS/VirR-VR-RNA級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控各種基因的表達(dá)[21]。因此，VirS/VirR系統(tǒng)是一種全局的基因調(diào)節(jié)因子，也是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要的調(diào)節(jié)因子之一。

除α-毒素基因外，產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒素基因都位于質(zhì)粒上。VirS/VirR系統(tǒng)雖位于染色體上，但它可以調(diào)節(jié)染色體和質(zhì)粒上的基因。例如，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株13中質(zhì)粒上的膠原粘附素基因(cna)和β-2毒素基因(cpb2)都受VirS/VirR系統(tǒng)調(diào)節(jié)。cna受該體系負(fù)調(diào)控，cpb2受正調(diào)控[22]。

cpb編碼產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素(CPB)，它是由B型和C型菌株產(chǎn)生的主要毒素，其引起出血性壞死性腸炎。據(jù)報(bào)道，C型菌株產(chǎn)生的CPB受VirS/VirR系統(tǒng)調(diào)控[23]。CPB是C型菌株必需的腸道毒力因子[24]。VirS/VirR通過調(diào)節(jié)CPB的產(chǎn)生致使C型菌株致病[23]。VirS/VirR系統(tǒng)是控制染色體和質(zhì)粒上基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

VirS/VirR系統(tǒng)還可通過調(diào)節(jié)蛋白水解所需的蛋白酶活性來調(diào)節(jié)iota毒素的活性。Iota毒素是E型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的主要毒素。Iota毒素以無活性形式產(chǎn)生，需要蛋白酶的水解來激活。據(jù)報(bào)道，未成熟蛋白的裂解是由VirS/VirR依賴性蛋白酶來完成的[25]。

2.2VirS/VirR系統(tǒng)對其它基因的調(diào)控 VirS/VirR系統(tǒng)不但調(diào)節(jié)毒素基因，還對其它基因進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究人員通過差異顯示法對VirS/VirR調(diào)節(jié)的基因進(jìn)行了鑒定，鑒定到3個(gè)克隆。通過核苷酸測序和Northern雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)：1個(gè)質(zhì)粒上的metB(胱硫醚γ-合成酶)，cysK(半胱氨酸合酶)和ygaG(假設(shè)蛋白)基因受負(fù)調(diào)控，而第2個(gè)質(zhì)粒上的ptp(蛋白酪氨酸磷酸酶)和cpd(2′， 3′-環(huán)核苷酸2′-磷酸二酯酶)基因顯示受VirR/VirS系統(tǒng)的正調(diào)節(jié)。第3個(gè)質(zhì)粒上的hyp7基因受到VirR/VirS系統(tǒng)的正調(diào)控，hyp7可激活產(chǎn)氣莢膜梭菌中colA和plc基因的轉(zhuǎn)錄，但不激活pfoA基因的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明，全局調(diào)節(jié)系統(tǒng)VirR/VirS可以正向和負(fù)向調(diào)節(jié)毒素基因以外的各種基因，并且hypl基因可能編碼產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素新的調(diào)節(jié)因子[26]。

據(jù)報(bào)道，VirS/VirR系統(tǒng)能感知細(xì)胞[27]：C型產(chǎn)氣莢膜梭菌與Caco-2細(xì)胞接觸，產(chǎn)氣莢膜梭菌會迅速上調(diào)毒素表達(dá)，而VirR突變體即使與菌株相同類型的細(xì)胞接觸也不能誘導(dǎo)毒素產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)表明，VirS/VirR系統(tǒng)對于感知環(huán)境(特別是環(huán)境中的細(xì)胞)和上調(diào)毒素產(chǎn)生是非常重要的[27]。

基因組分析表明產(chǎn)氣莢膜梭菌缺少參與氨基酸生物合成相關(guān)的基因[8]，因此，產(chǎn)氣莢膜梭菌在宿主體內(nèi)生長，必需降解宿主組織并將產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)快速轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌細(xì)胞中。產(chǎn)氣莢膜梭菌的這種能力對于其在宿主中存活和生長是必不可少的，因此，它會依據(jù)不同環(huán)境來上調(diào)毒素及酶的產(chǎn)生。當(dāng)產(chǎn)氣莢膜梭菌識別宿主細(xì)胞并準(zhǔn)備降解宿主細(xì)胞時(shí)，通過與Caco-2細(xì)胞接觸而導(dǎo)致的毒素上調(diào)很明顯是其中的一種反應(yīng)[28]，但尚不知道產(chǎn)氣莢膜梭菌是如何識別Caco-2細(xì)胞的。

2.3VirS/VirR和QS信號合成系統(tǒng) 雙組分系統(tǒng)毒力相關(guān)基因的表達(dá)受QS調(diào)控，該系統(tǒng)由QS信號合成系統(tǒng)和VirS/VirR雙組分系統(tǒng)組成。最近發(fā)現(xiàn)pfoA基因在細(xì)菌的對數(shù)生長中期短暫表達(dá)；此后，它的表達(dá)被迅速關(guān)閉，這表明存在一個(gè)自群體淬火(self-quorum quenching, sQQ)系統(tǒng)。添加靜止期培養(yǎng)上清液可誘導(dǎo)該sQQ系統(tǒng)發(fā)揮作用。sQQ系統(tǒng)是一種小分子物質(zhì)，具有熱穩(wěn)定性，可通過超濾膜過濾篩選。此外，sQQ系統(tǒng)也可由濃度上與靜止期培養(yǎng)物相同的純乙酸和丁酸誘導(dǎo)，表明產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的有機(jī)酸參與sQQ系統(tǒng)。在控制pH的分批培養(yǎng)物中，sQQ系統(tǒng)明顯減弱；pfoA的表達(dá)延長至對數(shù)生長后期，最終增加了1個(gè)數(shù)量級。此外，與上述有機(jī)酸相同pH條件下，鹽酸也可誘導(dǎo)sQQ系統(tǒng)發(fā)揮作用，靜止期培養(yǎng)上清液會抑制VirS/VirR調(diào)控的基因表達(dá)?？偟膩碚f，產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒力因子的表達(dá)受到sQQ系統(tǒng)的下調(diào)，而sQQ系統(tǒng)是由主要酸性代謝物和酸性環(huán)境介導(dǎo)的，這表明采用控制pH將成為抵抗細(xì)菌毒力的一種新策略[29]。

Singh等[30]對靶定VirS/VirR雙組分系統(tǒng)的QQ肽進(jìn)行了研究。根據(jù)構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)果他們設(shè)計(jì)了2種不同的類型QQ肽，這2種類型的肽在微摩爾濃度水平時(shí)會抑制pfoA的轉(zhuǎn)錄。利用QQ化療法有望治療由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的傳染病，如氣壞疽和壞死性腸炎。

3 VirR結(jié)合位點(diǎn)的鑒定

為了深入研究VirS/VirR的調(diào)節(jié)機(jī)制，鑒定VirR結(jié)合位點(diǎn)是一項(xiàng)重要工作。對pfoA啟動子區(qū)域的分析顯示在該區(qū)域中存在不完全的直接重復(fù)序列CCCAGTTNTNCAC[31]。使用定點(diǎn)誘變，DNase I足跡分析和凝膠移位分析顯示該序列為VirR結(jié)合基序，這些序列被指定為VirR框[32]。VirR能獨(dú)立地結(jié)合到位于pfoA基因上游的2個(gè)VirR框。此外，這些VirR框之間的距離和它們與pfoA啟動子的35區(qū)的距離對于VirR介導(dǎo)的激活作用是相當(dāng)重要的。

研究人員對產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株13基因組序列VirR框基序搜索發(fā)現(xiàn)，只有5個(gè)基因在其啟動子區(qū)域具有VirR結(jié)合位點(diǎn)，包括pfoA和編碼VR-RNA的vrr基因[8]。其它3個(gè)基因是ccp基因(它編碼半胱氨酸蛋白酶，a-clostripain)和2個(gè)假定基因virT和virU[7]，virT和virU兩者都編碼RNA調(diào)節(jié)分子[33]。已經(jīng)證明這5個(gè)基因的VirR框都是功能性的[33]，VirR激活這5個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。

virT基因緊挨著ccp基因。對virT突變體及其互補(bǔ)衍生物進(jìn)行分析表明，VirT RNA在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)調(diào)節(jié)pfoA和ccp[33]。不是所有已知序列的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株中都存在virT基因，它僅存在菌株13和ATCC3626中[34]。VirU的過表達(dá)可激活pfoA，ccp，vrr和virT的轉(zhuǎn)錄[33]。這兩種RNA調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)水平并不強(qiáng)烈，它們對由VirS/VirR調(diào)控的基因的表達(dá)進(jìn)行微調(diào)。

研究發(fā)現(xiàn)ATCC13124中的2個(gè)VirR框，SM101中的1個(gè)VirR框都與VirR結(jié)合[35]。這些基因大多數(shù)編碼假定蛋白質(zhì)，但其中一些可能編碼調(diào)節(jié)性RNA分子，如VirT和VirU。研究還在位于質(zhì)粒上的毒素基因啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了VirR框。例如，發(fā)現(xiàn)編碼產(chǎn)氣莢膜梭菌成孔毒素NetB基因上游具有VirR框。NetB的產(chǎn)生受VirS/VirR系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，并且VirR與netB基因上游的VirR框結(jié)合[36]。在菌株JFP718中netE和netG毒素基因上游也存在VirR框[37]，它們的功能尚不清楚。NetB是禽類壞死性腸炎的關(guān)鍵毒力因子[38]。因此，VirS/VirR系統(tǒng)通過控制不同菌株中不同毒素的產(chǎn)生來控制不同致病力菌株的毒力。

4 展 望

隨著細(xì)菌基因組序列的公布，運(yùn)用生物信息學(xué)的方法和系統(tǒng)性突變的方法己經(jīng)成功鑒定幾種產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素和酶的調(diào)控系統(tǒng)，并對其功能進(jìn)行了研究。但是與其它致病菌相比，我們對該菌的毒力調(diào)節(jié)機(jī)制知之甚少。對艱難梭菌和肉毒桿菌的研究發(fā)現(xiàn)某些氨基酸、特定氨基酸混合物、葡萄糖和σ因子影響或抑制某些細(xì)菌毒素的產(chǎn)生[38-40]。產(chǎn)氣莢膜梭菌中也可能存在類似的毒素調(diào)控機(jī)制。因此，我們需要對產(chǎn)氣莢膜梭菌毒力調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行更廣泛深入的研究，詳盡闡明毒力相關(guān)基因的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，為開發(fā)新型抗菌制劑提供新的靶點(diǎn)，進(jìn)而全面地抵抗產(chǎn)氣莢膜梭菌感染。

利益沖突：無