劉春香，隋 銘，劉春霞，向春玲，曹紅祥，常天利，尹晨霖

(濰坊學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，“十三五”山東省高等學(xué)校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261061)

濰坊青蘿卜又稱(chēng)為濰縣青，品質(zhì)優(yōu)，秋茬栽培的濰縣青作為地理標(biāo)志名牌產(chǎn)品，深受歡迎。濰縣青蘿卜易于抽薹，早春栽培風(fēng)險(xiǎn)大，在周年供應(yīng)方面成了限制因素。在晚抽薹育種方面，徐文玲等[1]育成的北選濰青2號(hào)是具備濰縣青特點(diǎn)的適合山東各地進(jìn)行秋冬、冬春設(shè)施保護(hù)地栽培的改良品種，抽薹率比對(duì)照降低23%，但仍有22.7%的抽薹率。目前，選育的早春蘿卜主要是白蘿卜[2]。針對(duì)地方品種改良，經(jīng)典的育種方法就是回交，適合單基因或主效基因控制的性狀[3-4]，或存在標(biāo)記的數(shù)量性狀[5]，雖然周期長(zhǎng)，最終是可以實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)的。

蘿卜抽薹相關(guān)基因的調(diào)控是復(fù)雜的[6]，有報(bào)道認(rèn)為蘿卜抽薹性狀受主基因控制[7]，并且第1對(duì)主基因?qū)Τ榕_(tái)時(shí)期的控制較高。為了尋找對(duì)耐抽薹有影響的基因，張素君[8]在極耐抽薹材料中克隆獲得一個(gè)成花座位C基因(Flowering locus C，F(xiàn)LC)的cDNA全長(zhǎng)，與早抽薹FLC序列間存在15個(gè)堿基的差異。黃丹瓊[9]對(duì)多個(gè)不同抽薹特性蘿卜品系RsFLC基因序列的分析發(fā)現(xiàn)FLC基因的內(nèi)含子區(qū)存在變異，其中在內(nèi)含子1和內(nèi)含子2中存在與植株材料抽薹特性顯著相關(guān)的插入-缺失型差異區(qū)域，與晚抽薹性狀密切相關(guān)，但沒(méi)有報(bào)道序列及序列長(zhǎng)度。白菜中鑒定了4個(gè)FLC基因[10-11]，在蘿卜中有2個(gè)FLC[12]。越來(lái)越多的研究證實(shí)FLC2成為抽薹開(kāi)花時(shí)期的關(guān)鍵基因[12-13]。FLC蛋白不僅會(huì)對(duì)擬南芥的開(kāi)花產(chǎn)生抑制作用，而且在其他開(kāi)花植物成花的過(guò)程中也起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[14]。如白菜[15]、花椰菜、油菜[16]中FLC功能也已得到驗(yàn)證[17]。FLC是成花轉(zhuǎn)變的樞紐基因[18]，大量的報(bào)道認(rèn)為FLC2是影響抽薹期早晚的首選QTL位點(diǎn)[19-20]。通過(guò)FLC過(guò)量表達(dá)，可使植物晚開(kāi)花[20]，延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期。重要的與開(kāi)花相關(guān)的基因FT[21]、FD、SOC、LFY、FLD、VRN等都與FLC存在一定的關(guān)系[22]。未春化的植株FT等產(chǎn)物甚至可以通過(guò)嫁接春化過(guò)的砧木實(shí)現(xiàn)開(kāi)花[23]。

蘿卜自然群體中存在基因多態(tài)性，點(diǎn)突變、插入缺失等可以引發(fā)抽薹期改變，F(xiàn)LC2編碼框的插入引發(fā)的翻譯提前終止可以引發(fā)早花[10, 24]。白菜內(nèi)含子區(qū)的長(zhǎng)插入序列可以引發(fā)晚抽薹[25]。低溫途徑通過(guò)抑制FLC2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)成花轉(zhuǎn)變，該過(guò)程中SVP蛋白與FLC互作[26-27]，抑制成花相關(guān)基因FT的表達(dá)，植物通過(guò)了春化才能解除抑制，促進(jìn)FT表達(dá)[28]，向成花轉(zhuǎn)變。

栽培上的低溫蘿卜很難克服，因此，低溫途徑促進(jìn)開(kāi)花需要從基因水平控制。長(zhǎng)日照(赤霉素途徑)促進(jìn)開(kāi)花，早春栽培正是日照逐漸變長(zhǎng)的過(guò)程，也很難從栽培上克服。本研究以早春白蘿卜為晚抽薹基因源，從2013年起，將晚抽薹性狀按照質(zhì)量性狀轉(zhuǎn)育的方式轉(zhuǎn)到濰縣青蘿卜上，并研究了FLC2基因第1內(nèi)含子區(qū)，探索FLC2第1內(nèi)含子區(qū)是否存在多態(tài)性，以及多態(tài)性與抽薹期的關(guān)系。試驗(yàn)過(guò)程意外發(fā)現(xiàn)春化時(shí)間對(duì)FLC2擴(kuò)增的影響，本研究在回交轉(zhuǎn)育蘿卜的過(guò)程中，以探索FLC2基因內(nèi)含子區(qū)PCR檢測(cè)的條件及應(yīng)用為目標(biāo)，為蘿卜晚抽薹育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 回交供體、輪回親本及常規(guī)選育過(guò)程

本研究以改良地方品種濰縣青蘿卜的春季抽薹特性為目標(biāo)，以晚抽薹的西星白玉春蘿卜(由登海種業(yè)鄧永林先生提供)為晚抽薹基因源，于2013年以濰縣蘿卜為父本，進(jìn)行雜交；2014年進(jìn)行F1自交，2015年F2花期進(jìn)行晚抽薹性及皮色、根型的選擇，入選植株以濰縣青蘿卜為輪回父本進(jìn)行回交，連續(xù)回交3代，至2018年回交3代的蘿卜花期進(jìn)行自交或姊妹交，選擇晚抽薹性好，其他性狀符合濰縣青蘿卜特點(diǎn)的植株種子為材料，于2018年6月采收種子。

1.2 F2晚抽薹株群FLC2基因的PCR擴(kuò)增分析

在NCBI上檢索蘿卜FLC2基因序列(在GenBank上的編號(hào)： GI: 756809027)，用Primer Premier 5.0分別進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，命名時(shí)基本按照在基因上的位置命名(圖1)。引物對(duì)1的序列和名稱(chēng)如下，上游序列S379：5′-TTCTCCAAACGACGCAGT-3′，下游序列為a1599：5′-GGCTTTAAGATCATCAGCATG-3′；引物對(duì)2的上游序列S484：5′-TCTCCAAACG ACGCAGTGGTCTCAT-3′，下游引物a1704：5′-TCAT CAGCATGTTGTTTTCCATATCG-3′。以上述2對(duì)引物進(jìn)行基因組FLC2基因區(qū)間見(jiàn)圖1，擴(kuò)增的群體主要是晚抽薹入選植株和輪回親本植株。擴(kuò)增條件：PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL體系，其中蘿卜DNA模板濃度平均為30 ng/μL，加1 μL，2×Taq酶混合液(ExTaq酶)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，混合于1管，加蒸餾水補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火引物對(duì)1是52.8 ℃ 30 s，引物對(duì)2是60.5 ℃，延伸72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；后延伸72 ℃ 10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，檢測(cè)結(jié)果。

圖1 FLC2基因上的引物位置Fig.1 Primer sites on FLC2 gene

1.3 多態(tài)性片段的克隆和測(cè)序

對(duì)F2中高頻出現(xiàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)片段和輪回親本的擴(kuò)增產(chǎn)物短片段進(jìn)行TA克隆，克隆菌落進(jìn)行雙向測(cè)序和序列拼接(委托上海生工生物技術(shù)公司)，對(duì)測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，分析多態(tài)性的序列特征。并利用DNAStar的序列比對(duì)軟件進(jìn)行兩序列比較。

1.4 將FLC2第1內(nèi)含子的多態(tài)性作為參考檢測(cè)其與抽薹性的關(guān)系

按照CTAB法對(duì)F2分植株進(jìn)行基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增采用1.2中的引物對(duì)2進(jìn)行。調(diào)查植株抽薹期，以花臺(tái)高約2 cm作為抽薹的標(biāo)準(zhǔn)，分析PCR擴(kuò)增多態(tài)性與抽薹的關(guān)系。

1.5 回交群體和部分晚抽薹自交群體經(jīng)春化處理后FLC2第1內(nèi)含子的檢測(cè)

通過(guò)對(duì)回交種子和少部分晚抽薹自交種子進(jìn)行催芽，對(duì)幼苗進(jìn)行12，36 d的4 ℃低溫春化處理，處理后于3月中旬定植到濰坊學(xué)院溫室，分別進(jìn)行抽薹期的調(diào)查和FLC2第1內(nèi)含子多態(tài)性分析，5月初結(jié)束抽薹統(tǒng)計(jì)。取處理后和抽薹期的植株葉片，采用CTAB法分別進(jìn)行基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增方法同上。定植后開(kāi)始統(tǒng)計(jì)各植株的抽薹期。

1.6 春化處理后對(duì)FLC2內(nèi)含子區(qū)擴(kuò)增的檢測(cè)

重新對(duì)FLC2第1內(nèi)含子區(qū)插入序列兩端設(shè)計(jì)引物，其中引物對(duì)3與引物對(duì)4上游序列是一致的，為S604，序列: 5′-ACCAGAATGAGGAAGAACA-3′，引物對(duì)3下游序列a3為: 5′-AACATCAAGTCTGCG TCA-3′；引物對(duì)4的下游序列a4為5′-ATCAATG GCTGCACAAT-3′。用來(lái)對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增區(qū)間如圖1所示。同時(shí)，對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行抽檢，抽檢引物從蘿卜基因組中隨機(jī)選擇了一段序列，P1: 5′-TGTGATTTATACAGCTTCCATAT-3′，P2: 5′-AGAACTTGCCTTCCTTGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物700 bp左右。

于2018年進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)照1為西星白玉春，基因型為內(nèi)含子有插入突變和無(wú)插入突變的雜合型，對(duì)照2為輪回親本濰縣青，F(xiàn)LC2基因第1內(nèi)含子為野生型；其他為回交1代后代。蘿卜的處理方式：植株長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)定為春化0 d，此后放在保鮮柜中4 ℃處理12，24 d，處理結(jié)束的當(dāng)天每個(gè)單株取少量葉片提取DNA；處理后繼續(xù)低溫至通過(guò)春化，之后定植到田間，抽薹開(kāi)花期取臺(tái)?；蚬v皮提取DNA，單株編號(hào)，分別提??；提取方法仍為CTAB法，試驗(yàn)所選樣品為后期晚抽薹的雜合型植株，淘汰早抽薹植株DNA。PCR反應(yīng)體系同上，引物對(duì)3擴(kuò)增條件為預(yù)變性94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火52 ℃，延伸72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；后延伸72 ℃ 10 min。DNA質(zhì)量檢測(cè)擴(kuò)增條件同引物對(duì)4，引物對(duì)4的擴(kuò)增條件僅退火溫度降為50 ℃，其他不變。

2 結(jié)果與分析

2.1 回交轉(zhuǎn)育過(guò)程的抽薹期分析

盡管蘿卜抽薹期表現(xiàn)為數(shù)量性狀，為了將晚抽薹相關(guān)基因轉(zhuǎn)化到濰縣青蘿卜中，本研究最初采用回交-自交結(jié)合的模式進(jìn)行晚抽薹性狀的轉(zhuǎn)育，本研究發(fā)現(xiàn)，輪回親本濰縣青蘿卜50%植株抽薹時(shí)間為3月5日；供體親本西星白玉春抽薹50%植株抽薹時(shí)間為4月6日。2015年F2出現(xiàn)了明顯的性狀分離現(xiàn)象，商品性一般，入選植株晚抽薹性較好，平均抽薹時(shí)間為4月14-19日，從圖2可見(jiàn)入選的4株蘿卜在5月2日有2株還沒(méi)有開(kāi)花。說(shuō)明F2部分晚抽薹植株性狀可優(yōu)于親本西星白玉春，顯著好于輪回親本濰縣青。

按照數(shù)量性狀的轉(zhuǎn)育方法，如沒(méi)有輔助選擇手段，每一代需要富集影響抽薹的各種基因，采用回交后自交或高世代選擇，這樣會(huì)延長(zhǎng)育種進(jìn)程。本研究根據(jù)植物開(kāi)花已有的報(bào)道，選擇成花樞紐基因FLC2作為關(guān)注的主效基因，對(duì)F2及回交世代進(jìn)行基因型檢測(cè)，探索其基因型對(duì)抽薹的影響，對(duì)以后的回交世代選擇起了一定作用，每次回交后不用再自交。

圖2 F2部分入選晚抽薹植株及對(duì)照在5月2日的抽薹開(kāi)花Fig.2 Part of flowering of selected plants from F2 generation and control plant on May 2nd

2.2 蘿卜FLC2基因外顯子1和外顯子2間基因組擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)對(duì)蘿卜FLC2基因的部分序列進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該基因有一定的擴(kuò)增難度，引物對(duì)1不能擴(kuò)增出理想的結(jié)果(S379、a1599)，而引物對(duì)2(S484、a1704)能夠有效擴(kuò)增出產(chǎn)物，且產(chǎn)物的大小不一致，從圖3可以看出，對(duì)照濰縣青蘿卜擴(kuò)增帶1 220 bp，而晚抽薹植株都是擴(kuò)增出2 848 bp的產(chǎn)物。由此可知，在不同蘿卜基因組DNA上FLC2基因存在序列長(zhǎng)短的差異，即多態(tài)性。這種差異需要通過(guò)克隆測(cè)序才能明確產(chǎn)生的原因。而且需要驗(yàn)證這種差異是否與抽薹性密切相關(guān)。

2.3 蘿卜FLC2擴(kuò)增多態(tài)性片段的克隆和序列比對(duì)分析

通過(guò)將目的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，對(duì)2個(gè)不同的插入片段分別選擇2個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，同一大小的片段間序列是一致的，從圖4可以看出，小片段的FLC2基因內(nèi)含子與大片段內(nèi)含子的上游和下游都是一致的，只是在中間從320-1 949位置有一個(gè)1 628 bp的插入序列。

將這個(gè)插入序列在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)基本沒(méi)有完全一致的已知序列，在甘藍(lán)基因組序列中，存在同源性較高(83%)的約900 bp的同源性片段，該片段功能尚未鑒定。其次是歐洲油菜中有約712 bp同源性85%的mRNA序列，而從920-1 500 bp間沒(méi)有任何相似的序列。由此可知，這個(gè)長(zhǎng)內(nèi)含子是由插入突變引起的，插入位置在第1內(nèi)含子的中部，并不影響FLC2基因的編碼序列，可導(dǎo)致內(nèi)含子序列和長(zhǎng)度發(fā)生變化，片段應(yīng)與十字花科植物序列有親緣關(guān)系。

圖3 兩對(duì)引物FLC外顯子1到外顯子2間基因組擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Genomic amplification results of two pairs of primers on FLC from exon 1 to exon 2

圖中粗線為省略部分，該部分2個(gè)序列間是一致的；三角號(hào)表示內(nèi)含子插入序列的起點(diǎn)和終點(diǎn)。The bold dotted lines in the figure are omitted sequences, and the two sequences are consistent； The triangle indicates the beginning and end of insertion sequences on the first intron.

2.4 插入突變基因型與晚抽薹的關(guān)系

通過(guò)對(duì)2015年所有晚抽薹植株的PCR擴(kuò)增分析得出(表1)：有85.71%的晚抽薹植株含有純合的FLC2插入突變序列(2 848 bp擴(kuò)增帶)，有92.86%較晚抽薹植株含有雜合或純合的插入突變序列(2 848，1 220 bp共存或純合2 848 bp)。說(shuō)明晚抽薹株普遍表現(xiàn)出含有插入突變序列的帶型。2015年由于在花期僅存少量入選的晚抽薹植株和濰縣青花粉供體株，樣本量較少，為了進(jìn)一步確定其作為晚抽薹篩選標(biāo)記的可靠性，2016年進(jìn)一步進(jìn)行晚抽薹性PCR檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2，從表2可以看出，經(jīng)過(guò)花期檢測(cè)的基因型為純合插入突變的植株全部是晚抽薹(85.7%)和較晚抽薹(14.3%)的，另有部分植株最終沒(méi)有抽薹，PCR檢測(cè)結(jié)果不清晰，沒(méi)有參與統(tǒng)計(jì)；純合野生型(濰縣青，擴(kuò)增產(chǎn)物1 220 bp)沒(méi)有晚抽薹植株，全部是早抽薹(81.1%)和較晚抽薹(19.0%)?；蛐蜑殡s合型的主要是較晚抽薹的(78.3%)。說(shuō)明FLC2的基因型與抽薹早晚關(guān)系很密切。值得一提的是這些結(jié)果必須基于花期的檢測(cè)，苗期和春化未完成時(shí)期的檢測(cè)有時(shí)帶型是不全的。要以這一特征作為抽薹早晚的選擇標(biāo)記需進(jìn)一步探索其適用的條件。

表1 2015年插入突變帶型與抽薹統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics of insertion mutation zone type and bolting plants on 2015

表2 2016年蘿卜PCR檢測(cè)到的插入突變帶型與抽薹期比例的關(guān)系Tab.2 The relationship between insertion mutation by PCR detection and bolting stage ratio on 2016 %

2.5 春化處理對(duì)擴(kuò)增的影響

利用引物對(duì)2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，期望通過(guò)不同春化時(shí)間處理獲得不同育種材料抽薹期的特征，并檢測(cè)抽薹早晚與擴(kuò)增結(jié)果間的關(guān)系，進(jìn)一步明確晚抽薹與FLC2插入突變的關(guān)系。從表3可以看出，春化處理36 d對(duì)擴(kuò)增有明顯影響，1 220 bp帶(野生型，WT)多數(shù)植株能夠擴(kuò)增出來(lái)，有部分植株不能得到擴(kuò)增產(chǎn)物；而春化處理12 d的植株則完全不能擴(kuò)增出1 220 bp的WT帶型，僅在部分植株中能夠擴(kuò)增出2 848 bp的帶。說(shuō)明苗期春化處理對(duì)引物對(duì)2擴(kuò)增FLC2基因結(jié)果是有明顯影響的，短期春化主要影響野生型FLC2內(nèi)含子的擴(kuò)增，長(zhǎng)時(shí)間春化主要影響插入突變型FLC2的擴(kuò)增?；ㄆ跀U(kuò)增則多數(shù)植株都可以得到正常結(jié)果，與實(shí)際基因型相符，且抽薹期極晚接近5月抽薹的植株100%都是純合插入突變基因型。

表3 蘿卜在2種春化天數(shù)下各基因型的PCR檢測(cè)帶型及抽薹早晚Tab.3 The counts and ratio of bolting time and PCR amplification products of radish under two different vernalization days

注： 早春定植后植株依賴(lài)自然低溫大部分最后開(kāi)花，部分植株最終也沒(méi)有開(kāi)花，無(wú)法檢測(cè)基因型，不參與統(tǒng)計(jì)。

Note: Most of the plants depend on natural low temperature to blossom finally after planting in early spring，some plants do not bolting at last so they can not be detected genotypes and can not be counted.

2.6 春化處理對(duì)內(nèi)含子區(qū)擴(kuò)增的影響

春化處理會(huì)影響FLC2基因的擴(kuò)增結(jié)果，且引物對(duì)2擴(kuò)增難度大，為了降低擴(kuò)增難度，對(duì)已經(jīng)測(cè)序的內(nèi)含子區(qū)重新設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)篩選引物對(duì)3的擴(kuò)增效果較好。為了驗(yàn)證春化對(duì)PCR擴(kuò)增FLC2的影響，需要對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)2種基因型未經(jīng)春化處理植株的引物擴(kuò)增效率進(jìn)行檢測(cè)，從圖5可知，春化24 d的基因組DNA對(duì)擴(kuò)增蘿卜育性相關(guān)基因RSRF是沒(méi)有影響的, 都有產(chǎn)物。未經(jīng)春化處理的蘿卜DNA擴(kuò)增引物對(duì)3可以擴(kuò)增出CK1(雜合)的2條帶和CK2(純合野生型)的1條帶，由此可以確定引物、酶和DNA都是正?？捎玫摹?/p>

圖5 檢驗(yàn)蘿卜春化24 d DNA質(zhì)量的RSRF基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 RSRF gene amplification results of radish after vernalization 24 d for DNA quality detection

通過(guò)引物對(duì)3對(duì)FLC2第1內(nèi)含子基因型為雜合型的不同春化時(shí)期蘿卜單株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖6，從圖6可以看出，春化0 d和抽薹開(kāi)花期，蘿卜植株基本能夠檢測(cè)到雜合型特征，即產(chǎn)物為雙帶，而春化24 d主要影響插入突變內(nèi)含子序列的擴(kuò)增，87%的植株無(wú)理想擴(kuò)增結(jié)果，有些WT帶的擴(kuò)增效果也受影響；同樣基因型，在苗期，尤其是抽薹或開(kāi)花期該有的帶型基本能擴(kuò)增出來(lái)。春化12 d則野生型帶(小帶)擴(kuò)增效果不好，插入突變型(大帶)也受到一定的影響。經(jīng)過(guò)引物對(duì)4擴(kuò)增以上材料也表現(xiàn)了相似的特征(圖7)，即春化24 d幾乎全部插入突變帶型擴(kuò)增均受影響，有時(shí)會(huì)額外出1條小帶；春化12 d有的出2條帶，有的出1條，有的1條也擴(kuò)增不出來(lái)。由此可以看出，引物更換雖然可以改變擴(kuò)增效率，但不能完全克服春化的影響。

M.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；CK1.未處理的西星白玉春；CK2.未處理的濰縣青；1-15.FLC2的雜合基因型植株。

M.Molecular Marker DL2000;CK1.Uncontrolled Baiyuchun;CK2.Uncontrolled Weixianqing;1-15.Plants with heterozygous genotype onFLC2.

圖6 不同春化時(shí)期蘿卜FLC2第1內(nèi)含子用引物對(duì)3的擴(kuò)增結(jié)果
Fig.6 Results of the first intron amplification of radishFLC2by primer pair 3 in different vernalization periods

M.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-10.FLC2的雜合基因型植株。M. Molecular Marker DL2000; 1-10. Plants with heterozygous genotype on FLC2.

2.7 FLC2第1內(nèi)含子多態(tài)性的適宜檢測(cè)時(shí)期及選種應(yīng)用

獲得FLC2第1內(nèi)含子多態(tài)性信息，且該多態(tài)性顯著影響回交材料的抽薹時(shí)期，雜合型較晚抽薹，純合突變型晚抽薹，育種上可以結(jié)合示意圖(圖8)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)育和篩選。

由于擴(kuò)增結(jié)果的最佳檢測(cè)時(shí)期是臺(tái)花期，苗期淘汰結(jié)果有時(shí)不夠可靠，不適合苗期篩選。在回交育種中，回交轉(zhuǎn)育后需要一步自交，有利于基因純合，在選擇自交后代是否基因型為純合時(shí)，可以通過(guò)擴(kuò)增檢測(cè)純合插入突變基因型，從而確保該等位基因(FLC2內(nèi)含子區(qū)基因型為純合插入突變)后代不發(fā)生分離，確保晚抽薹穩(wěn)定性。

通過(guò)臺(tái)花期檢測(cè)，可以明確晚抽薹是由FLC2基因第1內(nèi)含子插入突變引起，還是其他影響抽薹的作用因素引起，從而指導(dǎo)育種上的選擇，實(shí)現(xiàn)非等位基因的累加。經(jīng)過(guò)選擇的回交3代植株普遍性狀符合濰縣青蘿卜特征，且早春抽薹期平均比對(duì)照晚30 d左右。

3 結(jié)論與討論

FLC2基因是成花轉(zhuǎn)變的樞紐基因[18]，植物通過(guò)抑制FLC2基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)成花轉(zhuǎn)變[12]，蘿卜與擬南芥在春化途徑上具有相似性[29]。有研究認(rèn)為，F(xiàn)LC2表達(dá)的抑制作用主要在FLC2的啟動(dòng)子到第1內(nèi)含子區(qū)[17, 30-31]，因此，本研究也選用該區(qū)域作為檢測(cè)對(duì)象，并發(fā)現(xiàn)了在FLC2第1內(nèi)含子區(qū)存在一個(gè)長(zhǎng)插入突變，長(zhǎng)度約1 600 bp，沒(méi)有影響內(nèi)含子的邊界，因此，該插入突變并不影響FLC基因的編碼序列，這種長(zhǎng)插入在其他十字花科植物中也有[32]，油菜FLC2上游一個(gè)621 bp的插入引發(fā)冬性增強(qiáng)[33]，白菜中有報(bào)道發(fā)現(xiàn)了一個(gè)5 kb的插入突變，最終導(dǎo)致延遲抽薹開(kāi)花[25]，與本研究的結(jié)果類(lèi)似，說(shuō)明在FLC2內(nèi)含子區(qū)的長(zhǎng)插入序列的確有延遲抽薹開(kāi)花的作用。

斜體表示必需進(jìn)行檢測(cè)，非斜體表示可以檢測(cè)?！帘硎咎蕴?，表示自交。 Italics font indicates that it must be detected, and non-italics font indicates that it can be detected. ×denotes elimination, and denotes self-bred.

FLC2基因內(nèi)含子區(qū)的長(zhǎng)度差異是本研究育種材料的主要差異，因此，圍繞長(zhǎng)短內(nèi)含子的檢測(cè)可以預(yù)知材料是否含有導(dǎo)致晚抽薹的序列存在。黃丹瓊[9]也報(bào)道了FLC2基因擴(kuò)增長(zhǎng)度的差異，并認(rèn)為與抽薹早晚關(guān)系密切，可以將FLC2作為分子標(biāo)記[18]，與本研究基本一致；本研究雖與其采用的育種資源不同，但效果是相似的，重要的是在利用FLC2基因內(nèi)含子長(zhǎng)度作為標(biāo)記進(jìn)行篩選時(shí)遇到了困難。通過(guò)進(jìn)一步的春化處理研究，發(fā)現(xiàn)僅通過(guò)改進(jìn)引物是很難實(shí)現(xiàn)理想擴(kuò)增的，本研究為了對(duì)該內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，通過(guò)引物對(duì)3在苗期和開(kāi)花期基本可以實(shí)現(xiàn)正常擴(kuò)增。然而，春化階段則受到明顯影響，說(shuō)明春化階段模板DNA的狀態(tài)較為復(fù)雜。有研究認(rèn)為，F(xiàn)LC2基因的抑制是通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子到第1內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行大量的修飾，包括組蛋白甲基化[34-36]、非編碼RNA結(jié)合[37]、DNA甲基化[38]、組蛋白去乙酰化[28,39]、蛋白復(fù)合體結(jié)合等多種作用，期間涉及了FT[21-22,40]、FLD[14,40]、VIN等多種蛋白及蛋白復(fù)合體的作用[41]。這些修飾蛋白或結(jié)合蛋白可能通過(guò)苯酚-氯仿抽提并不能去除干凈，也可能其間有作用力較強(qiáng)的鍵難以通過(guò)有機(jī)溶劑變性分開(kāi)。2017年Kim等[42]報(bào)道發(fā)現(xiàn)FLC基因所在染色體在春化階段會(huì)因長(zhǎng)鏈非編碼RNA作用而成環(huán)，成環(huán)會(huì)影響DNA作為模板的功能。具體是什么機(jī)理導(dǎo)致PCR擴(kuò)增困難有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，同樣一株蘿卜的DNA，在不同階段FLC2第1內(nèi)含子擴(kuò)增難度不同，對(duì)引物對(duì)2，春化12 d野生型的擴(kuò)增困難，而春化36 d插入突變擴(kuò)增難度較大，推測(cè)短期春化，DNA上的修飾作用主要發(fā)生在野生型FLC2第1內(nèi)含子上，而較長(zhǎng)時(shí)間的春化可能引發(fā)了插入突變型內(nèi)含子區(qū)的大量修飾。然而，前人并未報(bào)道模板修飾會(huì)對(duì)DNA擴(kuò)增產(chǎn)生影響，因此，本研究采用了不同年度不同批次的多次試驗(yàn)，每次都能發(fā)現(xiàn)春化對(duì)擴(kuò)增的不良影響。最容易擴(kuò)增的時(shí)間段為抽薹開(kāi)花期，2種內(nèi)含子都能較好地實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，可能與抽薹開(kāi)花期FLC2的正常表達(dá)(修飾作用被解除)有關(guān)[15,43]。苗期擴(kuò)增需要引物合適，引物不適合苗期擴(kuò)增結(jié)果也不夠可靠。如果復(fù)雜的修飾影響PCR擴(kuò)增效率，通過(guò)擴(kuò)增效率反過(guò)來(lái)估計(jì)模板DNA的修飾狀態(tài)可能也是值得探索的問(wèn)題。

晚抽薹的影響因素較多[7,20]，本研究所采用的親本基因源較為單一，采用回交轉(zhuǎn)育轉(zhuǎn)有插入突變的FLC2基因型，抽薹這一數(shù)量性狀的轉(zhuǎn)育因而可以按照質(zhì)量性狀的轉(zhuǎn)育方法進(jìn)行[4]，到回交的最后一代，需要對(duì)有FLC2內(nèi)含子插入突變的基因型進(jìn)行純合，這時(shí)，標(biāo)記檢測(cè)可以明確預(yù)知后代的基因型，從而避免后代發(fā)生性狀分離。如果進(jìn)一步加強(qiáng)晚抽薹性育種，可以通過(guò)檢測(cè)插入突變等位基因是否純合判斷其對(duì)晚抽薹的貢獻(xiàn)，從而衡量其他基因的貢獻(xiàn)力，實(shí)現(xiàn)對(duì)晚抽薹有貢獻(xiàn)的其他基因的累積。