魏玲 楊國淋 王懷禹 李彩虹

（1，南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院 63700 ；2，川北醫(yī)學(xué)院 637000）

細(xì)小病毒病是寵物醫(yī)院臨床上常見的犬疾病，在感染該病后主要導(dǎo)致狗出現(xiàn)急性出血性腸炎和心肌炎，是一種高度傳染性的疾病，發(fā)病率高，死亡率高達(dá)60%，是最具威脅性的疾病之一[1]。目前，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，可以從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步了解CPV 的功能結(jié)構(gòu)，為CPV 病毒的真核或原核表達(dá)策略提供參考資料。此外，為CPV 膠體金快速診斷條帶基因工程疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。為進(jìn)一步了解和探索犬細(xì)小病毒的生長特性和增殖規(guī)律，為本病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

先通過登陸NCBI 網(wǎng)站，查詢VP2 基因的DNA 序列，然后采用分子生物學(xué)軟件對VP2 的蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行檢測分析，主要使用VP2An-the-2000 來完成；通過ProtScale 軟件對VP2 基因的疏水性進(jìn)行分析；通過http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi 完成蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析；通過http://emboss.bioinformatics.nl 完成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析；采用NetPhos 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/Net.Phos）分析CPV-VP2蛋白存在磷酸化位點(diǎn)，經(jīng)NetNGlyc1.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGbc）分析CPV-VP2蛋白存在的糖基化位點(diǎn)，采用Bcepred ( http://www.imtech.res.in/raghava/bce -pred/bcepred_submission.html) 分析CPV-VP2蛋白存在的B 細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP2 基因蛋白基本理化性質(zhì)分析

從NCBI 網(wǎng)站的核苷酸模塊中可以找到CPV-VP2 基因的全長DNA 序列，該基因的登錄號為KF803643。CPV 的VP2 DNA總長度為1755bp，其編碼氨基酸個(gè)數(shù)為584。經(jīng)過采用ProtParam 程序來預(yù)測VP2 基因氨基酸序列的基本特性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度為1g/L 時(shí)，結(jié)合半胱氨酸不形成二硫鍵的條件下，其光的吸收數(shù)值（Abs）為1.703，蛋白的不穩(wěn)定數(shù)值為28.91（＜40.00），此數(shù)據(jù)顯示了該基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。

2.2 VP2 基因的疏水性分析

CPV-VP2蛋白的最高親水值為-2.467，最高疏水值為2.178。通常，親水性氨基酸比疏水性氨基酸更均勻地分布，并且整條蛋白鏈呈現(xiàn)出親水性的特點(diǎn)。通過在線平臺檢測發(fā)現(xiàn)，CPV-VP2 沒有表達(dá)出蛋白的相關(guān)信息，且原核表達(dá)與編碼序列有著緊密聯(lián)系。本次研究發(fā)現(xiàn)，CPV-VP2蛋白屬于親水性，而且其氨基酸無顯著的跨膜現(xiàn)象，這一現(xiàn)象與疏水性相關(guān)分析有相似之處。

2.3 VP2蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

通過Phyre2 蛋白預(yù)測程序預(yù)測氨基酸序列的二維結(jié)構(gòu)。其中，α-螺旋區(qū)有58 個(gè)氨基酸，占9.05%，非常小。β 折疊區(qū)有143 個(gè)氨基酸，占25.77%，相對較大。不規(guī)則卷曲區(qū)域有383個(gè)氨基酸，占66.19%，占很大比例。

2.4 VP2蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

通過同源建模檢測CPV-VP2 相關(guān)理論的維度結(jié)構(gòu)區(qū)域，在線服務(wù)器主要使用SWISS-MODEL。檢測分析發(fā)現(xiàn)CPV-VP2的蛋白質(zhì)3 級結(jié)構(gòu)有折疊區(qū)域和螺旋區(qū)域，其顯著的特點(diǎn)為不規(guī)則。此外，還發(fā)現(xiàn)在VP2 的氨基酸位點(diǎn)上存在的殘基諾發(fā)生突變能形成不同的菌株，如CPV-2a 和CPV-2b，并且還可以影響CPV 的抗原特征。

2.5 CPV-VP2蛋白磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)分析

通過NetPhos 2.0 （ http://www.cbs.dtu.dk/services/Net.Phos）預(yù)測分析CPV-VP2蛋白磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在8 個(gè)絲氨酸 （Ser）位點(diǎn)，分別為27、110、156、221、226、344、519、542；酪氨酸的位點(diǎn)個(gè)數(shù)為7 個(gè)，分別為79、305、338、343、378、400、561；蘇氨酸（Thr）的位點(diǎn)個(gè)數(shù)為9 個(gè)，分別為31、155、187、221、242、271、388、389、455。經(jīng)典NetNGlyc1.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGbc）預(yù)測分析CPV-VP2蛋白一共含有7 個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別為25-NGSG、47-NQTE、64-NSSR、180-NNTM、443-NYTN、505-NLTN、S17-NMSR。

2.6 CPV-VP2 B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測

通過Bcepred 在線平臺分析發(fā)現(xiàn)，CPV-VP2蛋白存在6 個(gè)B 細(xì)胞抗原表位區(qū)域，見附表，其中22 和23 位點(diǎn)的抗原性指數(shù)最高。

3 犬細(xì)小病毒病臨床病例分析

通過對市區(qū)寵物醫(yī)院進(jìn)行臨床調(diào)查，共統(tǒng)計(jì)了61 例犬細(xì)小病毒病臨床病例，調(diào)查顯示，該病的治愈率為50.8% （31/61），死亡率為14.8% （9/61），遺棄或不明確的預(yù)后為34.4%（21/61）。入院時(shí)72.1% （44/61）病犬體溫超過39℃，8.2% （5/61）患者出現(xiàn)嘔吐，63.9% （39/61）病犬出現(xiàn)嚴(yán)重嘔吐和腹瀉。在所有受影響的狗中，70.5% （43/61）未接種疫苗。腸炎型細(xì)小病毒病主要發(fā)生在3 個(gè)月左右的幼犬中，潛伏期為7～14d，腹瀉后1～3d 為死亡高峰期。心肌炎在4～6 周齡的幼犬中更常見。該研究發(fā)現(xiàn)，該病的死亡率很高，應(yīng)優(yōu)先考慮預(yù)防。目前，疫苗接種是預(yù)防控制CPV 最具有療效的辦法。臨床上，選擇弱毒病毒疫苗進(jìn)行免疫接種，過程中嚴(yán)格按照相關(guān)程序進(jìn)行，以確保免疫接種準(zhǔn)確，不會(huì)跳過分裂[2]。Lu 等研究發(fā)現(xiàn)，在病毒衣殼蛋白的相關(guān)表位區(qū)域，氨基酸的非同義取代不但將抗原構(gòu)象發(fā)生一定的改變，還可以使CPV 發(fā)生進(jìn)化現(xiàn)象[3]。

4 討論

目前，關(guān)于細(xì)小病毒CPV-VP2蛋白功能的研究主要集中在MVMO，VP2蛋白分子量為83ku，細(xì)胞核中出現(xiàn)磷酸化蛋白，CPV-VP2蛋白可以與DNA 序列特異性結(jié)合，具有多種蛋白酶活性，參與病毒DNA 的復(fù)制，病毒基因表達(dá)調(diào)控及多種生理過程。在病毒DNA 復(fù)制中，細(xì)小病毒以類似于原核生物的發(fā)夾模式復(fù)制[4]。CPV-VP2蛋白特異性結(jié)合病毒復(fù)制（ACCA）2～3 序列的起始點(diǎn)，并在A 單鏈DNA 識別位點(diǎn)鄰近序列CTW-WTCA （W 代表A 或T）切入切口，產(chǎn)生3'-OH 作為A引物，在細(xì)胞聚合酶作用下進(jìn)行病毒DNA 復(fù)制，然后通過CPV-VP2蛋白酪氨酸磷酸鍵共價(jià)鍵在切口的5'末端，穩(wěn)定病毒DNA 鏈[5]。就細(xì)胞毒性而言，CPV-VP2蛋白主要影響幾種轉(zhuǎn)錄因子的生理活性，從而干擾這些細(xì)胞蛋白的功能并破壞細(xì)胞周期。在病毒感染A9 成纖維細(xì)胞以產(chǎn)生子代病毒過程中，VP2 在A9 細(xì)胞中引起的形態(tài)變化，導(dǎo)致細(xì)胞破裂和子代病毒釋放。發(fā)生這種變化是因?yàn)锳9 成纖維細(xì)胞的VP2 感染選擇性地改變細(xì)胞骨架細(xì)絲和中間纖維，導(dǎo)致f-肌動(dòng)蛋白和網(wǎng)格蛋白地顯著結(jié)構(gòu)重排和降解。

附表 CPV-VP2蛋白B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測

氨基酸疏水性可用作指示物，以確定蛋白質(zhì)是否是跨膜蛋白質(zhì)。如果發(fā)現(xiàn)多個(gè)親水/疏水區(qū)域在蛋白鏈中被分離，可以用作跨膜蛋白的標(biāo)記。在該研究中預(yù)測VP2蛋白的疏水性，親水性和跨膜結(jié)構(gòu)域表明，該蛋白質(zhì)沒有顯著的跨膜區(qū)。因此，CPV-VP2蛋白可能不是膜蛋白。CPV-2a 和CPV-2b 之間的差異是氨基酸376，氨基酸376 是VP2 的主要抗原位點(diǎn)（表位A），CPV-2a 的氨基酸376 是天冬氨酸（D）和CPV 的氨基酸376。VP2-2c 是谷氨酸（E）。1990 年以后測序顯示，CPV-2a的第555 個(gè)氨基酸大多數(shù)為纈氨酸[6]。李世靜等研究發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)中克隆的CPV-vp2 的380 處氨基酸是天冬氨酸，418 處氨基酸是丙氨酸（A），屬于新的“CPV-2a”型[7]。早在20 世紀(jì)80 年代，由表位組成的多膚疫苗被認(rèn)為是未來的終極疫苗。由于CPV 易于進(jìn)化突變，使用天然抗原的免疫效果不是很理想，也可能引起免疫耐受。在人類醫(yī)學(xué)中，天然抗原已被修飾以產(chǎn)生更多免疫原性抗原。但CPV-VP2 在天然抗原修飾方面的研究較少，深度研究分析CPV-VP2 的基因表位及抗原修飾的意義重大，以提高該病的預(yù)防與治愈效果。