王曉洪 史殿志 信吉偉

lncRNA是由超過200個核苷酸構(gòu)成,具備很多mRNA的結(jié)構(gòu)特性，包括3'端多聚腺苷酸尾、5'端帽子、啟動子、外顯子、內(nèi)含子等序列特征，但由于其缺乏開放閱讀框不能編碼蛋白質(zhì)[1，2]。lncRNA在生命過程中發(fā)揮重要作用。2017年Yang等在酒精性肝病患者中發(fā)現(xiàn)，LncRNA AK054921可能是潛在的酒精性肝病的血清標(biāo)記物[3]。目前國內(nèi)尚未見有關(guān)LncRNA AK054921和ALC的研究。本研究觀察了LncRNA AK054921在酒精性肝硬化(ALC)患者血漿中的表達及其臨床意義，旨在為ALC患者的臨床診治提供參考。

資料與方法

一、一般資料

選擇2014年2月至2017年7月我院收治的82例ALC患者作為研究對象，最終將符合入組標(biāo)準(zhǔn)的78例受試者納入研究。擇同期體檢的26例健康人(健康對照組)和酗酒但無肝病的35例受試者(酗酒組)進行對照。根據(jù)《酒精性肝病診療指南(2010年修訂版)》[4-5]診斷ALC。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<21歲；(2)合并慢性阻塞性肺疾病及糖尿病等；(3)心、腎功能衰竭；(4)合并腫瘤；(5)隨訪時間≥6個月。ALC組男性70例，女性8例，平均年齡(48.2±6.4)歲；酗酒組男性29例，女性6例，平均年齡(47.3±6.6)歲；健康對照組男性24例，女性2例，平均年齡(48.8±5.6)歲，其他一般資料詳見表1。三組受試者在性別、年齡方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本次研究139例受試者均簽署了知情同意書，且本項目經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

二、RT-qPCR法檢測LncRNA AK054921表達量

抽取受試者肘部靜脈血10 mL,3 500轉(zhuǎn)/min離心15 min，取離心后上清液于EP管中，-80 ℃環(huán)境下保存，待驗。用總RNA提取試劑盒(德國Qiagen Hilden公司)提取血清中總RNA，同時檢測其吸光度值，若OD260/OD280在1.8～2.0之間則進行后續(xù)實驗。取2 μg總RNA于反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國羅氏公司)中，合成cDNA,并將合成的cDNA置于PCR儀中，進行擴增。反應(yīng)條件為94 ℃ 10 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。用2-ΔΔCT表示受試者血漿中LncRNA AK054921的相對表達量。

三、信息收集

收集受試者性別、年齡、膽紅素(TBil)、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、白蛋白(Alb)、AST、ALT、MELD評分及Child-Pugh分級等信息。

四、ALC嚴(yán)重程度分級

根據(jù)Child-Pugh分級對78例ALC患者進行嚴(yán)重程度劃分，共分3組。Child-Pugh A級為輕度組，B級為中度組，C級為重度組。

五、預(yù)后隨訪

采用電話隨訪方式對78例ALC患者進行為期1年的隨訪，出院后開始隨訪，每月隨訪1次，隨訪截止時間為2018年7月25日。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。若計量數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用S-N-K檢驗；不服從正態(tài)分布用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(P25,P75)]表示，多組間比較采用Kruskal Wallis檢驗，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。LncRNA AK054921與TBil、INR和MELD評分的關(guān)系采用Spearman分析。用受試者工作特征(ROC)曲線評價各指標(biāo)的診斷效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 三組受試者基線資料比較

三組受試者在年齡、性別方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。酒精性肝損傷組患者TBil、INR、AST、ALT均高于健康對照組和酗酒組(P<0.05)，Alb低于健康對照組和酗酒組(P<0.05，見表1)。

二、 三組受試者LncRNA AK054921表達量比較

三組受試者血漿LncRNA AK054921相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ALC組血漿LncRNA AK054921相對表達量為2.5(2.0，3.0)，高于健康對照組和酗酒組[1.1(0.9，1.3)，1.4(1.1，1.5)；P<0.05]；酗酒組與健康對照組血漿中LncRNA AK054921的相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖1)。

表1 三組受試者基線資料比較

圖1 三組受試者血漿中LncRNA AK054921相對表達量比較

三、 不同嚴(yán)重程度的ALC患者血漿LncRNA AK054921相對表達量比較

輕度組、中度組和重度組患者血漿中LncRNA AK054921的相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。重度組患者血漿中LncRNA AK054921的相對表達量為3.7±0.9，高于中度組和輕度組[(2.5±0.4)，(2.0±0.6)；P<0.05]；中度組血漿中LncRNA AK054921的相對表達量高于輕度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

圖2 三組患者血漿中LncRNA AK054921的相對表達量比較

四、 不同嚴(yán)重程度的ALC患者1年生存率比較

78例ALC患者1年生存率為75.6%(59/78)。輕度組、中度組和重度組患者1年生存率分別為93.8%(30/32)、69.2%(18/26)和55%(11/20)(見圖3)。

圖3 三組患者1年生存曲線

五、 LncRNA AK054921及模型A評價ALC患者預(yù)后的價值

模型A評價ALC患者預(yù)后的logistic回歸方程F=-7.506-1.103×LncRNA AK054921-1.144×TBil-6.223×INR。LncRNA AK054921及模型A評價ALC患者預(yù)后的ROCAUC分別為0.685和0.938，均低于MELD評分診斷ALC患者預(yù)后的ROCAUC(Z=4.210，P<0.001；Z=0.740，P=0.459)。模型A評價ALC患者預(yù)后的ROCAUC高于LncRNA AK054921，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=3.798，P<0.001，見圖4、表2)。

圖4 LncRNA AK054921及模型A評價ALC患者預(yù)后的ROC曲線

討 論

ALC是由于長期飲酒或短期大量飲酒所致的嚴(yán)重肝臟疾病,常伴有不同程度的實驗室檢測指標(biāo)的異常，與其他原因引起的肝硬化有所不同[6]。目前，對ALC異常的檢測結(jié)果仍缺乏深入的認(rèn)識。膽紅素的變化在一定程度上反映了病情的輕重，AST/ALT的異?？稍谝欢ǔ潭确从尘凭愿螕p傷的程度，白蛋白是肝臟合成功能的主要指標(biāo)，但這些指標(biāo)難以精準(zhǔn)地評判患者肝臟病變程度及患者預(yù)后情況[7]。LncRNAs是一類近年來被發(fā)現(xiàn)的與多種疾病密切相關(guān)的RNA分子，在調(diào)節(jié)前列腺癌、胃癌、腎癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，然而在肝臟疾病中的研究較少[8]。對于LncRNAs異常表達則研究較少，能夠作為評估ALC損傷程度的LncRNAs更是少之又少。有研究表明，LncRNA AK054921在ALC中表達異常，且與肝臟病變程度密切相關(guān)。

表2 LncRNA AK054921及模型A評價ALC患者預(yù)后的效能

本研究結(jié)果顯示，ALC組患者血漿中LncRNA AK054921的相對表達量高于健康對照組和酗酒組，而酗酒組與健康對照組血漿中LncRNA AK054921的相對表達量差異不顯著，表明LncRNA AK054921在ALC患者血漿中高表達。我們又進一步探討了不同嚴(yán)重程度的ALC患者血漿中LncRNA AK054921的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者發(fā)病程度越嚴(yán)重，ALC患者血漿中LncRNA AK054921的表達量越高。TBil至MELD制定以來，因其能夠有效地預(yù)測終末期肝病短期、中期死亡率，并因檢測指標(biāo)容易獲得、評價客觀、便于人們計算，所以在肝病診治中應(yīng)用廣泛，具有很高的應(yīng)用價值[9]。TBil、INR和MELD作為ALC患者預(yù)后的重要評估指標(biāo)，我們均進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALC患者血漿中LncRNA AK054921相對表達量與TBil、INR和MELD評分均呈正相關(guān)關(guān)系，我們認(rèn)為LncRNA AK054921的相對表達量可用于評估ALC患者預(yù)后。我們繼續(xù)研究了LncRNA AK054921及模型A評價ALC患者預(yù)后的價值，結(jié)果顯示LncRNA AK054921及模型A評價ALC患者預(yù)后的ROCAUC分別為0.685和0.938，單獨檢測LncRNA AK054921對于評價ALC患者的預(yù)后價值較低，但是LncRNA AK054921結(jié)合TBil、INR共同評價ALC患者預(yù)后與MELD評分相近，說明三者相結(jié)合有望成為判斷ALC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的一項指標(biāo)。

綜上所述，ALC患者血漿中表達含量較高，且隨病情加重，其表達量升高。聯(lián)合檢測TBil、INR和LncRNA AK054921有助于ALC患者預(yù)后評估。LncRNA AK054921在肝臟疾病中的作用尚需深入研究。從肝臟疾病本身和LncRNA兩方面，加深理解LncRNA高表達的影響，有助于ALC機制的探討，為ALC的治療提供新思路。本實驗的不足在于樣本數(shù)量有限，有待于收集更大的實驗標(biāo)本量，結(jié)果的可信性將會更高。