夏振雄 周程

肝細胞癌惡性程度高、侵襲性強、病情進展快，患者早期癥狀不明顯，一旦出現(xiàn)癥狀就診，通常已屬中晚期，預(yù)后較差[1-3]。尋找腫瘤標記物以早期診斷、早期治療和開發(fā)有效藥物治療肝細胞癌就顯得十分重要。目前已有大量研究表明，F(xiàn)HIT、P16和MMP-9對肝細胞癌的診斷、治療及預(yù)后都有重要價值。本研究采用免疫組化技術(shù)對90例肝細胞癌標本進行檢測，探討FHIT、P16和MMP-9在肝細胞癌組織的表達及其與肝細胞癌病理特征的關(guān)系。

資料與方法

一、一般資料

收集本院2015年5月至2018年4月90例肝細胞癌患者的臨床資料和組織標本。其中男性60例，女性30例；年齡34～76歲，平均年齡(49.1±9.3)歲，其中≤50歲27例，> 50歲63例；腫瘤大小≤5 cm者58例，>5 cm者32例；低分化33例，高、中分化57例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者28例，陽性者62例；根據(jù)TNM肝臟腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期36例；有門靜脈癌栓形成者23例，無門靜脈癌栓形成者67例。全部組織標本均保存于醫(yī)院病理科，另取40例癌旁組織作為對照。

二、方法

(一)免疫組化法 組織經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，制成4 μm厚片備染。采用免疫組化SP方法：脫蠟、水化；抗原高壓修復(fù)；3%H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性酶；蒸餾水清洗后，抗原修復(fù)；血清封閉20 min，加一抗后4 ℃過夜；次日依次滴加生物素化二抗及辣根酶標記的鏈霉卵白素，各37 ℃ 30 min，PBS清洗；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；酒精分化后脫水、透明，封片后鏡檢。FHIT兔抗人單克隆抗體購自美國Sigma公司，P16兔抗人單克隆抗體購自上海微蒙酶聯(lián)試劑公司；MMP-9兔抗人單克隆抗體購自購自Zymed公司；免疫組化SP試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉試劑公司。陽性對照為已知的陽性切片，陰性對照采用PBS做一抗。

(二)結(jié)果判斷 細胞內(nèi)的FHIT、P16和MMP-9均定位于細胞漿中，陽性為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色或者棕黃色顆粒，不著色的細胞為陰性。在高倍鏡下隨機挑選10個不同視野計數(shù)，以百分率(%)表示陽性細胞數(shù)占全部腫瘤細胞數(shù)的比例：陽性腫瘤細胞數(shù)<10%為表達陰性；陽性腫瘤細胞數(shù)≥10%為陽性表達。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、FHIT、P16和MMP-9在肝細胞癌組織和癌旁組織的表達情況

90例肝細胞癌組織標本中有33例FHIT表達呈陽性，陽性率為36.7%(33/90)，癌旁組織29例陽性，陽性率72.5%(29/40)。肝細胞癌組織中FHIT蛋白的表達均顯著低于癌旁組織(χ2=14.253，P=0.000)。35例P16表達呈陽性，陽性率為38.9%(35/90)，癌旁組織31例陽性，陽性率77.5%(31/40)。肝細胞癌組織中P16蛋白的表達均顯著低于癌旁組織(χ2=16.518，P=0.000)。33例MMP-9表達呈陽性，陽性率為75.6%(68/90)，癌旁組織13例陽性，陽性率32.5%(13/40)。肝細胞癌組織中MMP-9蛋白的表達均顯著高于癌旁組織(χ2=21.859，P=0.000)。見圖1。

圖1 MMP-9在癌旁組織(a)和肝細胞癌組織(b)中的表達(DAB染色×100)

二、FHIT、P16和MMP-9表達與臨床指標之間的關(guān)系

FHIT、P16和MMP-9表達均與患者年齡和性別無關(guān)(P>0.05)，與其他臨床指標之間的關(guān)系各有不同。FHIT與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及門靜脈癌栓是否形成有關(guān)(P<0.05)；P16與腫瘤大小和分化程度有關(guān)(P<0.05)；MMP-9與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和門靜脈癌栓是否形成有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 肝細胞癌組織中FHIT、P16和MMP-9表達與臨床病理特征的關(guān)系

討 論

FHIT基因是脆性位點和腫瘤關(guān)聯(lián)的抑癌基因。FHIT蛋白在絕大多數(shù)正常組織器官中均有表達，通過誘導(dǎo)細胞凋亡、阻滯細胞生長來發(fā)揮抑癌作用，但在人類多種惡性腫瘤中(肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等)FHIT基因出現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄異常和表達缺失，其抑癌作用降低甚至消失。大量研究表明FHIT基因改變可能在惡性腫瘤的早期發(fā)生過程中占有重要地位[4-8]。本實驗結(jié)果表明，肝細胞癌組織中FHIT蛋白的表達顯著低于癌旁組織(36.7% vs. 72.5%)，F(xiàn)HIT與肝細胞癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及門靜脈癌栓是否形成有關(guān)，綜合上述結(jié)果可知FHIT與肝細胞癌的病程發(fā)展有密切關(guān)系，且與其分化的程度和腫瘤的轉(zhuǎn)移具有一定相關(guān)性。

P16基因被稱為多腫瘤抑制的基因，P16蛋白參與細胞周期的調(diào)控，具有負調(diào)控細胞增殖的作用[9-11]，對腫瘤產(chǎn)生有效抑制，在肺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌和腸癌等多種腫瘤中都檢測到P16基因或蛋白的高頻率突變和缺失，說明P16基因的異常和P16蛋白缺失可能在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用。本實驗結(jié)果表明，肝細胞癌組織中P16蛋白的表達顯著低于癌旁組織(38.9% vs. 77.5%)，P16的表達與腫瘤大小和分化程度有關(guān)，上述結(jié)果均提示P16低表達是肝細胞癌發(fā)生與發(fā)展過程中的一個重要事件。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特點之一。研究表明，細胞外基質(zhì)和血管基膜的降解與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。MMPs是一類降解細胞外基質(zhì)和基底膜的金屬依賴蛋白酶，一方面，MMP-9可通過破壞局部組織結(jié)構(gòu)和基膜屏障，促進腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，另一方面，MMP-9降解細胞外基質(zhì)和血管基膜，使腫瘤細胞進入門靜脈末端分支并種植于血管壁，形成癌栓[13]。本研究表明，癌組織中MMP-9顯著高表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、門靜脈癌栓是否形成有關(guān)，上述結(jié)果進一步佐證MMP-9在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制中具有重要意義。