竇冬冬 張楠 潘峰

人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)在人類中感染率非常高，我國一般人群HCMV抗體陽性率為86%～96%，嬰幼兒期為60～80%。國外報道先天性HCMV感染的發(fā)生率約為0.2%～2.0%[1-2]，國內約為0.2%～0.5%[3]。母親孕期將HCMV 傳播給胎兒，輕則隱性感染，重者可造成流產、死胎、畸形、生長受限等不良結局。諸多報道顯示，HCMV是嬰兒肝炎綜合征(Infant hepatitis syndrome，IHS)的主要致病因素[4-6]，然而對于先天性感染HCMV的患者其病毒對肝臟的損傷研究較少，臨床上常因癥狀隱匿或遲發(fā)，不易引起重視而錯過干預止損的最佳時機。因此，本研究通過HCMV感染孕鼠，建立先天性HCMV感染的子鼠模型，觀察其肝臟組織病理學改變，并檢測相關血清學指標，為進一步認識先天性HCMV感染對肝臟的早期損傷和早期診斷防治提供參考。

資料與方法

一、一般資料

30只SPF級Wistar大鼠[體質量(200±20)g，購自山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心]適應性喂養(yǎng)1周后，按雌∶雄=2∶1配對，見栓孕鼠隨機分為感染組和對照組，每組10只(每只單籠飼養(yǎng))。見栓后2～5 d，感染組大鼠腹腔內接種HCMV-AD169病毒懸液(0.1 mL/只)，對照組腹腔內接種等量的人胚肺細胞上清液(0.1 mL/只)，待其分娩并觀察各組孕鼠及子鼠一般情況。新生子鼠飼養(yǎng)1周后，每籠各取2只(每組20只)進行心臟采血，EDTA抗凝，用于檢測HCMV感染情況。其余子鼠分別于3、5、7周時每組各隨機選取10只心臟采血，留取血清分裝后于-80 ℃冰箱保存。同時留取相應時期肝組織，制作石蠟切片備用。

二、方法

(一)HCMV DNA檢測 采用核酸擴增熒光定量檢測方法，抗凝血液標本分離淋巴細胞并提取DNA，各取上清液5 μL(含病毒DNA)離心后分別加入若干HCMV-PCR反應管，設置PCR程序：93 ℃→2 min預變性，然后按93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s，10個循環(huán)，最后按93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30個循環(huán)。同時設置陰性質控品和陽性定量質控參考品梯度，記錄數據。檢測試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司。

(二)病理學檢查 對生后3、5、7周時兩組隨機選取的新鮮子鼠肝臟組織迅速固定、常規(guī)脫水及石蠟包埋，切片、烤片，進行HE染色，于光鏡下觀察肝組織普通病理。

(三)檢測血清ALT、肝纖維化指標水平 分別于3、5、7周時應用全自動生化分析儀檢測血清ALT水平。應用大鼠透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ.C)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(均購自北京科碩生物技術有限公司)按照說明檢測血清肝纖維化指標。在反應板樣品孔(設有空白)中加入不同濃度的待測樣品和標準品，37 ℃孵育120 min，再用洗滌液洗滌4～6次并扣干，加入一抗工作液混勻再次溫育、洗滌干燥、避光反應、加終止液檢測吸光值并換算相應含量。

(四)免疫組化檢測肝臟組織α-SMA蛋白的表達 對石蠟切片進行處理并采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物免疫組化試劑盒進行免疫細胞化學染色，一抗(武漢博示德生物技術有限公司)工作濃度均為1∶500，陰性對照為磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。結果判定：胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒為α-SMA陽性表達。

三、統(tǒng)計學方法

數據統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0 軟件。計量資料以均值±標準差表示，兩組比較采用t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、實驗動物一般狀況及子鼠HCMV檢測

(一)一般情況 感染組孕鼠注射病毒懸液后，有萎靡、聳毛、活動減少或躁動、食量減少等表現(xiàn)，子鼠成活率低，皮毛稀疏缺乏光澤，生長發(fā)育稍有緩慢，對照組孕鼠及子鼠一般情況良好。

(二)子鼠HCMV檢測 感染組HCMV陽性率為75.0%(病毒載量范圍4.05×103～4.84×107拷貝/mL，平均值4.67×105拷貝/mL)，對照組未見陽性子鼠。先天性人HCMV感染子鼠模型制作成功。

二、肝組織HE染色普通病理鏡檢

感染組子鼠生后3、5、7周時見肝小葉結構紊亂，肝索解離，細胞水腫、變性、壞死，大量淋巴細胞浸潤，肝竇充血明顯。對照組子鼠肝組織病理見肝細胞及肝小葉結構清晰正常，無淋巴細胞浸潤，肝竇無充血(圖1)。

三、血清ALT與肝纖維化指標水平

感染組子鼠在生后3、5、7周，血清ALT、肝纖維化指標水平均表現(xiàn)為高于同時期對照組子鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1～表3。

圖1 肝組織HE染色病理結果

表1 各組子鼠血清ALT測定(±s，IU·L-1)

表2 各組子鼠血清HA、LN測定(±s，ng·mL-1)

表3 各組子鼠血清PCIII、IV.C測定(±s，μg·mL-1)

四、肝組織α-SMA 蛋白表達水平

感染組子鼠3、5、7周肝組織匯管區(qū)及增生的纖維組織中α-SMA強陽性表達，肝竇內及肝細胞亦可見陽性表達細胞；對照組子鼠α-SMA主要表達與小動脈及小靜脈，且表達量低(圖2)。

圖2 肝組織α-SMA表達及分布

討 論

HCMV屬于皰疹病毒組DNA病毒，有廣泛的細胞嗜性，普遍易感于人體的多種細胞，可使受感染細胞出現(xiàn)直接損傷；另外，病毒引起的機體免疫病理反應可累及多個器官或系統(tǒng)。本研究中先天性HCMV感染的子鼠出現(xiàn)了一般狀況不良的表現(xiàn)，如存活率低、皮毛稀疏缺乏光澤，生長發(fā)育稍有緩慢等。

本研究觀察了先天性HCMV感染的子鼠肝臟病理學改變，結果發(fā)現(xiàn)肝組織出現(xiàn)明顯的肝炎樣改變。因肝活檢有創(chuàng)性的特點，少有關于HCMV感染者病理學改變的研究報道。龍梅等[7]曾對50例IHS嬰兒(34例感染HCMV)行B超介導的肝活檢病理檢查，所有患者均存在肝細胞水樣、氣球樣變性以及點、灶性壞死和凋亡小體的形成等表現(xiàn)。與本實驗中先天性HCMV感染的子鼠肝病理學改變類似，表明先天性HCMV感染確實對肝臟具有損傷作用。

血清ALT 和肝纖維化指標是反映肝功能受損，衡量炎癥活動度、纖維化程度的重要指標。在各種病毒性肝炎的急性期、藥物中毒性肝細胞壞死時，ALT可大量釋放入血從而被檢測到。血清肝纖維化指標常被用來間接反映纖維化的程度和輔助診斷，多項報道顯示，患HCMV感染性肝炎的嬰兒血清ALT和肝纖維化指標水平均高于健康嬰兒[6,8]，本研究也發(fā)現(xiàn)，先天性HCMV感染的子鼠血清ALT、HA、LN、IV-C、PCIII在肝臟發(fā)生損傷的早期即可有顯著升高，可能預示著肝臟的纖維化改變。肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)在致病因素的作用下激活并轉化為肌成纖維細胞(Myofibroblast，MF)，后者表達α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，是肝臟纖維化發(fā)生過程中的重要標志蛋白[9]。本研究檢測的感染組子鼠肝組織α-SMA水平高于對照組，提示先天性HCMV感染的子鼠肝臟可能正在發(fā)生纖維化改變，也與血清肝纖維化指標結果的意義相符。

綜上，先天性HCMV感染可導致一般狀況發(fā)育不良、肝功能受損及纖維化等病理損傷，且在生命早期即可檢測到血清標志物的改變。因此，降低母親孕期感染概率、避免胎兒受到HCMV的感染非常重要，另外，可以通過血清學等手段做好疾病的早期診斷和治療，避免產生不可逆的肝臟病理變化，改善預后。