林 晨 王銘偉 張?jiān)僦?林 楠 楊為錦 吳偉航 王 瑜

以妊娠高血壓綜合征為代表的妊娠期疾病是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生期胎兒死亡的主要原因之一，血管功能下調(diào)在其中扮演重要角色，臨近子宮的微小動(dòng)脈功能改變尤具研究價(jià)值[1～3]。目前測量微小動(dòng)脈舒縮功能的主流方法是用細(xì)金屬絲掛鉤勾住血管環(huán)，并通過張力轉(zhuǎn)換器將金屬絲傳導(dǎo)的牽張力進(jìn)行換算來表達(dá)血管環(huán)舒縮變化[3～5]。然而受限于金屬絲的口徑以及硬度，現(xiàn)有方法對(duì)微小動(dòng)脈舒張與收縮功能的測量僅僅局限于口徑大于300μm的微小血管，當(dāng)靶血管的口徑小于300μm，用現(xiàn)有的技術(shù)手段很難測量。在本研究中，筆者采用自主研發(fā)的新型雙針套接式微小動(dòng)脈舒縮功能測試儀對(duì)大鼠微小動(dòng)脈舒縮功能進(jìn)行測量，成功測得口徑小于300μm的大鼠子宮動(dòng)脈功能，為妊高癥血管功能改變的機(jī)制研究提供了更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.材料:(1)雙針套接式微血管功能測量裝置：由恒溫浴槽、可伸縮軟針、固定軟針、恒溫浴槽進(jìn)水口、出水口等五部分構(gòu)成。裝置主體為樹脂材料，采用3D打印而成，長8cm，寬5cm，高2cm，恒溫浴槽長5cm，寬3cm，高2cm，出水口直徑0.3cm，固定軟針以及可伸縮軟針為pet高分子材料制成，主體長度4cm，主體外徑0.15cm，尖端長度0.5cm，尖端直徑200μm；軟針外接輸液管道和夾閉器，可經(jīng)由軟針向血管腔內(nèi)輸注液體，夾閉器夾閉后可使血管腔形成閉合腔，其內(nèi)液體不與外接相交通。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)12周齡雌性未孕以及妊娠的Sprague-Dawley(SD)大鼠，健康，體質(zhì)量200±20g，由福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。傳統(tǒng)610 M 型多通道血管張力測定儀(含2根直徑80μm的不銹鋼絲掛鉤，丹麥DMT 公司)，恒溫浴槽購自寧波江南儀器廠，JH-280425張力換能器由福建醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供。其他組件包括倒置顯微鏡、攝像機(jī)、監(jiān)視器、示波器記錄儀、光源，均由尼康公司提供。試劑氯化鉀(potassium chloride，KCl)、去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)、 乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)由廈門鹿茸公司提供。

2.動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分A、B兩組，A組為12周齡雌性未孕SD大鼠， B組為12周齡雌性妊娠大鼠，妊娠時(shí)間18天，每組大鼠8～10只。兩組大鼠的腹主動(dòng)脈舒縮功能采用新型雙針套接式測量儀和傳統(tǒng)金屬絲掛鉤式測量儀分別測量，明確對(duì)于同組大鼠的腹主動(dòng)脈舒縮功能，采用新型測試儀與傳統(tǒng)儀器是否有差異；同時(shí)將采用相同測量儀器檢測的不同組的大鼠腹主動(dòng)脈舒縮功能做比較，明確不同組的大鼠腹主動(dòng)脈的舒縮功能是否發(fā)生變化，如果有差異，兩種儀器測得的差異趨勢是否一致。兩組大鼠的子宮動(dòng)脈無法采用傳統(tǒng)測量儀測量，僅采用新型微動(dòng)脈測試儀測量，明確不同組大鼠子宮動(dòng)脈的舒縮功能是否發(fā)生變化，如果存在差異，這種差異與兩組大鼠腹主動(dòng)脈功能的差異趨勢是否一致。

3.大鼠離體動(dòng)脈血管環(huán)制備以及裝置的連接：大鼠處死，取腎動(dòng)脈開口水平至髂動(dòng)脈分叉處之間的腹主動(dòng)脈管段，長度約3mm，同時(shí)取大鼠自子宮中央?yún)^(qū)向外側(cè)第2個(gè)胚胎所屬的子宮動(dòng)脈的血管段[6]，長度約3mm，血管段浸入4℃的Kreb液保存?zhèn)溆?。采用新型儀器測量時(shí)，將制備好的離體動(dòng)脈段浸泡于儀器的37℃恒溫水浴槽內(nèi)，置于顯微鏡的視野中心，血管段一端首先用精細(xì)顯微外科鑷套接在固定軟針尖端上，用10-0眼科尼龍單絲將其固定，從固定軟針向血管腔內(nèi)緩慢注入Kreb液，直至將血管腔中的血液以及雜質(zhì)完全去除，血管段另一端朝向可伸縮軟針尖端，將可伸縮軟針推向血管段的游離端，直至可伸縮軟針尖端也套入血管段，用10-0眼科尼龍單絲固定此端。將連接可伸縮軟針的輸液管外接到輸液袋上，袋中靜水壓保持在90mmHg。

4.檢測步驟：動(dòng)脈收縮功能檢測：采用51mmol/L氯化鉀溶液(51mmol/L KCl)刺激動(dòng)脈段/環(huán)2min，繪制時(shí)間-收縮百分比曲線；動(dòng)脈舒張功能檢測：采用3×10-7mol/L的NE預(yù)收縮5min，待血管的收縮達(dá)到平臺(tái)值并趨于穩(wěn)定后依次加入濃度梯度為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的ACh溶液，繪制劑量-舒張曲線[7,8]。每只大鼠的腹主動(dòng)脈段均取兩份，一份采用傳統(tǒng)儀器測量，一份采用新型儀器測量，比較兩種方法測得的動(dòng)脈舒張、收縮功能曲線。大鼠的子宮動(dòng)脈僅采用新型儀器測量。

5.組織學(xué)檢測：將測量后的血管段/環(huán)制成石蠟切片，蘇木素-伊紅(haematoxylin-eosin, HE)染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察血管壁的完整性以及血管內(nèi)膜情況。

6.血管舒縮程度計(jì)算公式:血管收縮百分比= [(靜息直徑 - 收縮直徑)/靜息直徑]×100%；血管舒張百分比=[(舒張直徑-NE預(yù)收縮直徑)/(靜止直徑 - NE預(yù)收縮直徑)]×100%[6,7]。

結(jié) 果

1.腹主動(dòng)脈舒張功能檢測結(jié)果：采用傳統(tǒng)方法導(dǎo)出的A組大鼠與B組大鼠腹主動(dòng)脈的ACh舒張百分比曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組的腹主動(dòng)脈對(duì)于ACh的舒張反應(yīng)小于A組(圖1A)。采用新型儀器導(dǎo)出的A組與B組大鼠腹主動(dòng)脈的ACh舒張百分比曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組大鼠的腹主動(dòng)脈對(duì)于ACh的舒張反應(yīng)小于A組(圖1B)。采用兩種方法導(dǎo)出的A組大鼠腹主動(dòng)脈在不同濃度梯度ACh作用下的劑量-舒張百分比曲線相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.645，圖1C)。同樣，采用兩種方法導(dǎo)出的B組大鼠腹主動(dòng)脈的ACh舒張百分比曲線相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.793，圖1D)。

圖1 腹主動(dòng)脈舒張功能測量A.采用傳統(tǒng)儀器測量大鼠腹主動(dòng)脈舒張功能；B.采用新型儀器測量大鼠腹主動(dòng)脈舒張功能；C.兩種方法繪制的A組大鼠腹主動(dòng)脈劑量-舒張曲線比較；D.兩種方法繪制的B組大鼠腹主動(dòng)脈劑量-舒張曲線比較

2.腹主動(dòng)脈收縮功能檢測結(jié)果：采用傳統(tǒng)儀器導(dǎo)出的A、B組大鼠腹主動(dòng)脈對(duì)于KCl的時(shí)間-收縮百分比曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.993，圖2A)。采用新型儀器導(dǎo)出的兩組大鼠腹主動(dòng)脈對(duì)于KCl的時(shí)間-收縮百分比曲線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.472，圖2B)。采用兩種方法導(dǎo)出的A組大鼠腹主動(dòng)脈對(duì)于KCl的時(shí)間-收縮百分比曲線相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.320，圖2C)。同樣，采用兩種方法導(dǎo)出的B組大鼠腹主動(dòng)脈對(duì)于KCl的時(shí)間-收縮百分比曲線相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.992，圖2D)。

圖2 腹主動(dòng)脈收縮功能測量A.采用傳統(tǒng)儀器測量大鼠腹主動(dòng)脈收縮功能；B.采用新型儀器測量大鼠腹主動(dòng)脈收縮功能；C.兩種方法繪制的A組大鼠腹主動(dòng)脈時(shí)間-收縮曲線比較；D.兩種方法繪制的B組大鼠腹主動(dòng)脈時(shí)間-收縮曲線比較

3.子宮動(dòng)脈收縮功能檢測結(jié)果：采用新型儀器導(dǎo)出的兩組大鼠子宮動(dòng)脈對(duì)于KCl的時(shí)間-收縮百分比反應(yīng)曲線相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.999，圖3A)。

4.子宮動(dòng)脈舒張功能檢測結(jié)果：采用新型儀器導(dǎo)出的兩組大鼠子宮動(dòng)脈的ACh的舒張百分比曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組大鼠的子宮動(dòng)脈對(duì)于ACh的舒張反應(yīng)小于A組(圖3B)。

圖3 子宮動(dòng)脈舒縮功能測量A.采用新型儀器測量大鼠子宮動(dòng)脈收縮功能；B.采用新型儀器測量大鼠子宮動(dòng)脈舒張功能

5.組織學(xué)評(píng)估：采用新型儀器檢測過的大鼠腹主動(dòng)脈(圖4A、圖4C)以及子宮動(dòng)脈(圖4E、圖4F)，血管壁完整，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜損傷；而采用傳統(tǒng)儀器測量的大鼠腹主動(dòng)脈(圖4B、圖4D)可發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)膜甚至血管平滑肌的損傷。

討 論

圖4 組織學(xué)評(píng)價(jià)A.采用新型儀器測量的A組大鼠腹主動(dòng)脈；B.采用傳統(tǒng)儀器測量的A組大鼠腹主動(dòng)脈；C.采用新型儀器測量的B組大鼠腹主動(dòng)脈；D.采用傳統(tǒng)儀器測量的B組大鼠腹主動(dòng)脈；E.采用新型儀器測量的A組大鼠子宮動(dòng)脈；F.采用新型儀器測量的B組大鼠子宮動(dòng)脈

微小動(dòng)脈的功能改變可能直接影響下游靶器官，因此在研究中更多采用外周微小動(dòng)脈而不是中央大動(dòng)脈作為靶器官功能改變的上游研究對(duì)象[9,10]。傳統(tǒng)的雙金屬絲掛鉤式微小動(dòng)脈功能測量裝置存在如下缺陷：(1)忽略了血管口徑和血管壁的厚度差異，對(duì)血管環(huán)各部分所造成的牽拉程度不一致，得到的數(shù)據(jù)無法真實(shí)的反應(yīng)實(shí)際情況[1,11～13]。(2)傳統(tǒng)檢測儀的金屬絲直徑約100μm左右，易對(duì)血管內(nèi)膜造成損傷，當(dāng)被測動(dòng)脈內(nèi)徑小于300μm時(shí)，很難將兩根金屬絲同時(shí)穿入血管環(huán)[8～12]。若縮小金屬絲口徑，過細(xì)的金屬絲無法承受血管環(huán)的拉力。(3)忽略了血管腔內(nèi)血壓對(duì)血管內(nèi)壁的影響。(4)在裝置內(nèi)，血管腔內(nèi)外的生物活性液是相交通的，施加干預(yù)時(shí)，無法分辨干預(yù)因素是對(duì)外膜起效還是對(duì)內(nèi)膜起效。(5)金屬絲本身的性質(zhì)差異有可能影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[14～16]。

采用雙針套接式微血管測量裝置可以不受上述因素影響，其優(yōu)勢如下：(1)可精確模擬生理或病理狀態(tài)的血管腔內(nèi)血壓，并可自由調(diào)整被測血管的前負(fù)荷。(2)可測量口徑300μm以下的微小動(dòng)脈。本實(shí)驗(yàn)中被測量的微小動(dòng)脈的最小口徑為230μm。套接軟針針頭組件可以根據(jù)被測血管的口徑進(jìn)行個(gè)體化更換。(3)采用本裝置進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，操作僅限于血管段的兩端，中間段被測血管的內(nèi)膜不會(huì)受到損傷。(4)血管腔內(nèi)的生物活性液與恒溫浴槽內(nèi)的生物液不相交通，可以對(duì)被測血管的外膜和內(nèi)膜獨(dú)立施加干預(yù)因素。

本研究顯示，妊娠期大鼠，不論子宮動(dòng)脈還是腹主動(dòng)脈，對(duì)于ACh介導(dǎo)的舒張性均小于未孕的大鼠，提示在妊娠狀態(tài)下，大鼠動(dòng)脈對(duì)ACh 誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張明顯降低，間接說明在妊娠狀態(tài)下，大鼠血管內(nèi)皮舒張功能下調(diào)，更易引發(fā)妊娠期高血壓。比較腹主動(dòng)脈和子宮動(dòng)脈，妊娠期ACh 誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往研究報(bào)道在缺血、缺氧的妊娠大鼠模型中，大鼠主動(dòng)脈對(duì)于ACh誘導(dǎo)的舒張功能顯著下降，提示缺血、缺氧狀態(tài)導(dǎo)致了血管內(nèi)皮舒張功能障礙，從而進(jìn)一步加劇妊高癥的發(fā)展[17]。而本研究結(jié)果提示，妊娠狀態(tài)本身也許就是妊高癥的獨(dú)立誘因。對(duì)于KCl誘導(dǎo)的收縮，不論是腹主動(dòng)脈還是子宮動(dòng)脈，兩組均未表現(xiàn)出差異，提示在妊娠期，KCl介導(dǎo)的電壓門鈣通道可能未受影響，或者有其他通路代償了該通路的功能。本研究將同組的大鼠腹主動(dòng)脈用兩種方法測量，不管是對(duì)于KCl誘導(dǎo)的時(shí)間-收縮曲線，還是ACh誘導(dǎo)的劑量-舒張曲線，兩種方法測得的結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示新的測量方法與已認(rèn)可的傳統(tǒng)方法比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，采用同種測量方法測量不同組的大鼠腹主動(dòng)脈，對(duì)于傳統(tǒng)測量方法已測得的差異，采用新測量儀器同樣可測出相同趨勢的差異。對(duì)于口徑小于300μm的微小血管在妊娠期血管內(nèi)皮舒縮功能改變的報(bào)道鮮見。筆者選取口徑為200～300μm的大鼠子宮動(dòng)脈作為研究對(duì)象，用新型儀器繪制其對(duì)KCl及ACh的反應(yīng)曲線，結(jié)果顯示雌性大鼠子宮動(dòng)脈對(duì)于ACh介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張功能在妊娠期顯著下調(diào)，填補(bǔ)了此領(lǐng)域空白。

當(dāng)然，本研究也存在不足之處：(1)測量指標(biāo)有限。在后繼的研究中，筆者還將加入左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛(indomehacin)等干預(yù)因素，使實(shí)驗(yàn)趨向系統(tǒng)性[10,13,18,19]。(2)選取的微小動(dòng)脈較單一。

綜上所述，本研究所述的雙針套接式微小動(dòng)脈測量裝置不僅可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的微小動(dòng)脈測量儀，還可以測量傳統(tǒng)儀器無法測量的口徑更小的微小動(dòng)脈，擁有廣泛的應(yīng)用前景，有望成為臨床以及藥理實(shí)驗(yàn)中測量血管功能的主流裝置。