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        酮康唑致人L02肝細(xì)胞毒性差異蛋白鑒定

        2019-11-04 07:20:00苗玉發(fā)康慧君王曉姝李路路張河戰(zhàn)
        醫(yī)學(xué)研究雜志 2019年9期

        苗玉發(fā) 康慧君 王曉姝 李路路 張河戰(zhàn)

        酮康唑是一種吡咯類抗真菌藥,文獻(xiàn)報(bào)道可以通過干擾細(xì)胞色素P-450的活性,抑制真菌細(xì)胞膜主要固醇類物質(zhì)的生物合成,損傷真菌細(xì)胞膜并改變其通透性,導(dǎo)致重要的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏,從而達(dá)到殺菌抑菌作用。KTZ還可以抑制真菌的三酰甘油和磷脂的生物合成,抑制氧化酶和過氧化酶的活性,引起細(xì)胞內(nèi)過氧化氫積聚導(dǎo)致細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)變性和細(xì)胞壞死[1]。2011年8月31日,國家食品藥品監(jiān)督管理局在第40期《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》中提醒警惕KTZ 200mg口服片劑的嚴(yán)重肝毒性,但是,KTZ致人肝損傷的毒性機(jī)制仍不完全清楚 。

        本研究將KTZ和人L02肝細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)體外肝細(xì)胞毒性,通過雙向電泳法篩選差異蛋白,并通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)種類,探討KTZ對(duì)人肝細(xì)胞的毒性機(jī)制。

        材料與方法

        1.主要試劑:KTZ(美國Sigma公司);L02人肝細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所);RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司);胎牛血清(美國Gibco公司);DMSO(美國Sigma公司);考馬斯亮藍(lán)(美國Promega公司);0.25%胰酶(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);重泡漲液(美國Biorad公司);蛋白Marker(中科院上海生物化學(xué)研究所);CCK-8檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);活性氧檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);全細(xì)胞蛋白提取試劑盒(美國Epigentek公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

        2.主要儀器:5810R型臺(tái)式高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);熒光顯微鏡(日本Olympus公司) ;恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);電子分析天平(日本島津公司);Ettan IPGphor等電聚焦電泳儀(瑞典Amersham公司);Ettan DALT twelve system SDS-PAGE電泳儀(瑞典Amersham公司);UMAX ImageScanner凝膠掃描儀(美國GE healthcare公司);UV-2550分光光度計(jì)(日本島津公司); ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)。

        3.實(shí)驗(yàn)方法:(1)藥液的配制:KTZ臨用前以培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的終濃度。(2)細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇凍存的細(xì)胞,離心去除凍存液,加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液(pH值7.2),于37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)。細(xì)胞生長到80%后,加入lml 消化液(含0.02%EDTA,0.25%胰酶)消化,待細(xì)胞變圓,間隙增大時(shí),棄消化液,加入2ml培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液待用[2]。(3)CCK-8法檢測KTZ對(duì)人L02肝細(xì)胞增殖的影響:將單細(xì)胞懸液調(diào)至105/ml濃度,96孔板每孔100μl放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,至完全貼壁,然后加入30、50、80、100mg/L濃度的KTZ 10μl,培養(yǎng)2、4、6和8h后收集上清,加入新鮮不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基100μl,加CCK-8溶液10μl繼續(xù)培養(yǎng)2~4h,然后測定450nm處的加藥細(xì)胞的吸光度值(試驗(yàn)組A值)。同時(shí)設(shè)置空白組(培養(yǎng)基和CCK-8溶液,無細(xì)胞)和對(duì)照組(不加藥的培養(yǎng)基和CCK-8溶液,有細(xì)胞)。細(xì)胞增殖抑制率(%)= (對(duì)照組A值-試驗(yàn)組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%[3,4]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算平均增殖抑制率。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測KTZ對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的影響:將單細(xì)胞懸液調(diào)至105/ml濃度,96孔板每孔加100μl后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,至完全貼壁,然后加入30、50、80、100mg/L濃度的KTZ 10μl共培養(yǎng)4h和6h,棄上清,PBS洗1次,加DCFH-DA(5μmol/L) 50μl,37°C孵育30min,含3% FBS的PBS洗兩次,加50μl PBS重懸,上機(jī)檢測[5]。對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度設(shè)定為100,其他組熒光強(qiáng)度與對(duì)照組進(jìn)行比較,來表示胞內(nèi)活性氧的多少。(5)蛋白樣品制備:將80mg/L KTZ培養(yǎng)6h的人肝細(xì)胞作為進(jìn)一步研究對(duì)象。收集的對(duì)照組細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別設(shè)有3個(gè)復(fù)樣,對(duì)照組樣本編號(hào)為C1-55622、C1-55623和C1-55630,實(shí)驗(yàn)組樣本編號(hào)為T1-55625、T1-55626和T1-55627。蛋白質(zhì)提取方法按照美國Epigentek公司提供的說明書進(jìn)行,Brad-ford 法測定蛋白濃度,液氮保存?zhèn)溆谩?6)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE):將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各1.0mg蛋白質(zhì)加入重泡漲液中,使總體積為450μl,用等電聚焦儀按如下程序自動(dòng)進(jìn)行: 12h重泡漲;250V,0.5h;1000V,0.5h;8000V,9h,總電壓時(shí)間約為52000Vh。結(jié)束后, 將膠條分別放入5ml平衡液Ⅰ(2% DTT)和5ml 平衡液Ⅱ(含2.5% 碘乙酰胺)中各平衡15min, 然后進(jìn)行第二向垂直平板SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[6~8]。(7)圖像分析:將膠塊放入考馬斯亮藍(lán)R-250中染色,然后在脫色液中脫色至背景清晰,得到6張考染圖。然后對(duì)凝膠進(jìn)行拍攝,用Imagemaster 7.0軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析,選取3倍以上的差異點(diǎn)作為目的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析。(8)差異蛋白酶解及質(zhì)譜分析: 沿染色區(qū)邊緣切下凝膠中目的蛋白質(zhì)點(diǎn),放入0.5ml試管中,200μl超純水37℃浸泡30min,在100μl脫色液[ACN (乙腈)∶100mmol/L碳酸氫銨=3∶7]中震蕩脫色30min,重復(fù)2~3遍,直到膠塊和脫色液無色;將膠塊浸入100% ACN中15min,真空離心干燥5min;加入10~15μl Trypsin酶液,4℃放置45min,37℃空氣浴9~11h,吸出反應(yīng)液置EP 管中;加入33%ACN和0.1%TFA(三氟乙酸)50μl, 輕微振蕩萃取30min,瞬時(shí)離心,吸上清置EP管中。再用含66%ACN和0.1%TFA,以及含100% ACN和0.1%TFA的萃取液各萃取一次?;旌仙鲜鲆后w(反應(yīng)液和3次萃取液)冷凍真空抽干至5~6μl,4℃冰箱保存。質(zhì)譜分析時(shí)凍干樣品管中加入3μl 50% ACN/0.5% TFA 溶解,加基質(zhì)溶液3μl, 混勻后取1μl 點(diǎn)樣于不銹鋼板上,空氣自然干燥后在ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析[9~11]。(9)數(shù)據(jù)庫檢索:使用Mascot檢索軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中檢索質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)。使用國際互聯(lián)網(wǎng)UniProt提供的數(shù)據(jù)庫查詢蛋白質(zhì)功能,查詢地址:https://www.uniprot.org/。

        結(jié) 果

        1.KTZ對(duì)人L02肝細(xì)胞增殖的抑制作用:細(xì)胞增殖抑制率隨著KTZ劑量的增加和作用時(shí)間的延長而顯著上升。KTZ濃度為80mg/L和100mg/L時(shí),與對(duì)照組比較,各時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KTZ濃度為50mg/L時(shí),作用4h后對(duì)細(xì)胞的增殖抑制比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KTZ濃度為30mg/L時(shí),作用6h后對(duì)細(xì)胞的增殖抑制比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞增殖抑制率與藥物濃度呈正相關(guān),濃度越高,對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用越強(qiáng),增殖率為負(fù)數(shù)時(shí),表示KTZ在該濃度對(duì)細(xì)胞無抑制作用,結(jié)果見圖1。

        圖1 不同KTZ濃度作用人L02肝細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞增殖的抑制率

        2.KTZ對(duì)人L02肝細(xì)胞ROS的影響:當(dāng)KTZ濃度≥80mg/L時(shí),與對(duì)照組比較,4h和6h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度均顯著升高(P<0.01),即胞內(nèi)活性氧顯著性升高,結(jié)果見圖2。

        圖2 不同KTZ濃度作用人L02肝細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度比值與對(duì)照組比較,*P<0.01

        3.雙向凝膠電泳結(jié)果:通過細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)和胞內(nèi)ROS實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)KTZ濃度≥80mg/L時(shí),在不同時(shí)間點(diǎn),都會(huì)產(chǎn)生顯著性的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡。因此,收集與80mg/L KTZ共培養(yǎng)6h的人肝細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,進(jìn)行蛋白提取及雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。通過與對(duì)照組比較,共獲得17個(gè)蛋白差異點(diǎn)。與對(duì)照組比較,含量增加的點(diǎn)有38、149、360、427、1683、1750、1763、1765、1827和1836(圖3,以點(diǎn)38為代表);與對(duì)照組比較,含量減少的點(diǎn)有93、375、399、423、451、1098和1992(圖4,以點(diǎn)399為代表)。

        圖3 點(diǎn)38的雙向凝膠電泳圖

        圖4 點(diǎn)399的雙向凝膠電泳圖

        4.差異蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果:質(zhì)譜鑒定出有意義的蛋白,且通過UniProt數(shù)據(jù)庫查詢與細(xì)胞毒性相關(guān)的上調(diào)蛋白4個(gè),下調(diào)蛋白 3個(gè),結(jié)果見表1。

        表1 差異蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果

        討 論

        真核生物60S酸性核糖體蛋白(60S acidic ribosomal protein)大亞基上有P0、P1和P2 3種核糖體蛋白,由于它們的等電點(diǎn)在酸性范圍內(nèi),且通常又被一些蛋白激酶磷酸化,故稱為酸性核糖體P蛋白。這些蛋白質(zhì)在核糖體上形成由五聚體復(fù)合物(P1/P2)2-P0組成的向外凸出的莖區(qū)結(jié)構(gòu),此莖區(qū)與核糖體上的28S rRNA的一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域共同形成一個(gè)GTPase相關(guān)位點(diǎn),并在蛋白質(zhì)翻譯延伸過程中起重要作用。研究表明酸性核糖體蛋白P參與蛋白質(zhì)的合成,維持生命穩(wěn)定性,還具有參與DNA修復(fù),細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞分化等調(diào)控過程。此外,酸性核糖體P蛋白還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細(xì)胞凋亡以及許多疾病有關(guān)[12,13]。

        ROS是氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應(yīng)的含氧自由基,在生理狀態(tài)下,機(jī)體產(chǎn)生的自由基與抗氧化防御系統(tǒng)處于相對(duì)平衡。在病理狀態(tài)下,機(jī)體產(chǎn)生大量自由基,會(huì)造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞。KTZ能增加人肝細(xì)胞的胞內(nèi)ROS,從而誘導(dǎo)人肝細(xì)胞凋亡。腺苷酸激酶2(adenylate kinase 2,AK2) 是位于線粒體內(nèi)膜中的腺苷酸激酶亞型,其mRNA在肝臟、心臟、骨骼肌和胰腺中含量較高,在腎臟、胎盤和大腦中略少。但是,AK2蛋白在肝臟、腎臟和心臟中高表達(dá),在肺和骨骼肌中低表達(dá)。該酶在線粒體中的定位表明其在細(xì)胞增殖和凋亡的能量需求中起重要作用。在凋亡過程中,AK2能與Fas相關(guān)死亡域蛋白和caspase-10結(jié)合形成復(fù)合物從而激活一種新的細(xì)胞凋亡通路,但其具體機(jī)制仍不清楚[14]。

        Ras GPT酶活化蛋白結(jié)合蛋白1 (ras GTPase-activating protein-binding protein 1,G3BP1)具有結(jié)合ATP、DNA、mRNA和RNA的活性,具有依賴ATP的DNA和RNA解螺旋酶活性以及核酸內(nèi)切酶活性。有研究表明G3BP1能與HCV病毒的非功能區(qū)蛋白5B和反義鏈RNA的5′-相互作用,可能是 HCV復(fù)制復(fù)合物的一個(gè)組成部分[15]。本研究中Ras GPT酶活化蛋白結(jié)合蛋白1的上調(diào)可能與KTZ導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過程有關(guān),具體機(jī)制仍待深入研究。

        丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvate dehydrogenase complex,PDHc)主要由丙酮酸脫氫酶(E1)、二氫硫辛酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(E2)、二氫硫辛酸脫氫酶(E3)和一些輔助因子組成的多酶復(fù)合物,E1亞單位是由兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基組成的異構(gòu)四聚體。E1、E2和E3以首尾相連的形式將丙酮酸不可逆的氧化脫羧,將乙?;D(zhuǎn)移給輔酶A,從而形成重要的物質(zhì)乙酰輔酶A,在細(xì)胞線粒體呼吸鏈能量代謝中起重要作用。臨床上,丙酮酸脫氫酶E1α亞基突變或者磷酸化是丙酮酸脫氫酶缺乏的主要原因,也是兒童乳酸酸中毒和早發(fā)性、退行性、神經(jīng)變性病的最常見的病因。此外,在兩個(gè)病例中發(fā)現(xiàn)由E1β亞基缺陷導(dǎo)致的乳酸酸中毒和肌張力低下[16]。 本研究中細(xì)胞毒性發(fā)生時(shí),E1 α亞基和 β亞基表達(dá)均增強(qiáng),可能與細(xì)胞呼吸鏈能量代謝變化有關(guān)。

        血紅素是血紅蛋白和其他血紅素蛋白的輔基,當(dāng)血紅素蛋白降解時(shí),血紅素幾乎轉(zhuǎn)變成膽紅素和一氧化碳。這一轉(zhuǎn)變過程是由血紅素加氧酶和膽綠素還原酶(biliverdin Ⅸ alpha reductase)催化完成。膽綠素還原酶是一種胞質(zhì)酶,哺乳動(dòng)物的膽綠素還原酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為34000,且為單體分子。在NAD(P)H存在時(shí),膽綠素還原酶能將膽綠素IXα還原成膽紅素Ixα[17]。肝細(xì)胞毒性發(fā)生時(shí)膽綠素還原酶下調(diào),可能與細(xì)胞凋亡過程有關(guān)。

        本研究用蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定出與細(xì)胞毒性相關(guān)的上調(diào)蛋白4個(gè),下調(diào)蛋白3個(gè),提示KTZ誘導(dǎo)細(xì)胞毒性發(fā)生時(shí),細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了一系列復(fù)雜的變化,包括基因表達(dá)變化、能量代謝變化和血紅素代謝變化。這些差異性蛋白可能在藥物毒性誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用,這也是KTZ細(xì)胞毒性機(jī)制研究的重要方向。

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