■羅學(xué)評(píng) 張安青 袁國(guó)尚 姜海波,4* 文 明
(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng)550025;2.高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng)550025;3.銅仁市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局漁業(yè)技術(shù)推廣站,貴州銅仁554300;4.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng)550025)
虹鱒(Oncorhynchus mykiss)是我國(guó)重要的冷水性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。近年來(lái)隨其人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)的不斷成熟,養(yǎng)殖規(guī)模在不斷擴(kuò)大,然而高密度養(yǎng)殖模式下的虹鱒肌肉品質(zhì)也隨之下降。這成為限制虹鱒食用消費(fèi)和加工利用的重要因素,制約了虹鱒養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展。探尋改善虹鱒肌肉品質(zhì)的方法已經(jīng)成為學(xué)者的研究熱點(diǎn)。魚(yú)類肌纖維作為骨骼肌的基本構(gòu)成單位,在某種程度上決定了肌肉的品質(zhì),其特征被普遍用于魚(yú)肌肉品質(zhì)的評(píng)定[1-3]。肌纖維(Myofiber)是由胚胎發(fā)育過(guò)程中分化出的肌源性祖細(xì)胞,分化形成單核的成肌細(xì)胞(Myoblasts),然后單核的成肌細(xì)胞融合,形成多核的肌管(Myotube),肌管之間再相互融合而形成。并伴隨著一系列基因的表達(dá)變化。肌衛(wèi)星細(xì)胞是一種特殊的肌源性干細(xì)胞,具有促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)和自我修復(fù)的功能。而生肌調(diào)節(jié)因子家族(MRFs)在肌衛(wèi)星細(xì)胞分化后期到肌管形成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[4]。
MRFs 家族編碼4 種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子,分別是生肌決定因子(myogenic determining factor,MyoD)、肌細(xì)胞生成素(myogenin,MyoG)、生肌因子5(myogenic factor 5,Myf5)和生肌因子6(myogenic factor 6,Myf6),該家族控制著肌肉的發(fā)育,包括從前體肌細(xì)胞的定型、增殖及肌纖維的形成,直到個(gè)體出生后肌肉的成熟和功能的完善整個(gè)過(guò)程[5]。由此可見(jiàn)MRFs 的表達(dá)對(duì)肌肉品質(zhì)的提升息息相關(guān)。杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)屬杜仲科,杜仲屬,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值[6],是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)物種,在我國(guó)也有著豐富的資源。在傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)中,杜仲具有除腰膝酸痛,補(bǔ)肝腎,延緩衰老,強(qiáng)筋骨,改善糖代謝等功效[7-8]。目前,杜仲除在醫(yī)學(xué)上得到廣泛應(yīng)用外,近年來(lái)在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中的研究和應(yīng)用也呈增加趨勢(shì),有關(guān)報(bào)道已見(jiàn)于草魚(yú)[9-12]、鯉魚(yú)[13]、異育銀鯽[14]、羅非魚(yú)[15]、豬[16-17]、雞[18]等,這些研究表明杜仲具改善肌肉品質(zhì),提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能,改善機(jī)體免疫等功效。本研究團(tuán)隊(duì)在前期的研究中發(fā)現(xiàn)飼料中添加1%、4%的杜仲皮水提物能顯著降低虹鱒肌纖維直徑,肌纖維的密度隨著杜仲水提物濃度的增加而增大,0.5%、1%、2%、4%組的肌纖維密度均顯著高于0%組[19]。本研究通過(guò)在虹鱒的基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度的杜仲皮水提物,分析其對(duì)虹鱒肌肉MRFs 基因表達(dá)的影響,以期從分子生物學(xué)方面初步探究杜仲皮水提物對(duì)肌纖維調(diào)控的機(jī)理,為杜仲作為水產(chǎn)動(dòng)物肉質(zhì)改良劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。
基礎(chǔ)飼料(山東升索漁用飼料研究中心生產(chǎn)的商業(yè)虹鱒飼料)含粗蛋白質(zhì)為42.0%、粗脂肪為18.0%、粗灰分為8%、粗纖維為6%,經(jīng)粉碎過(guò)40 目篩后稱重備用。試驗(yàn)共設(shè)5 個(gè)處理組,在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%(對(duì)照組)、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的杜仲皮水提物。試驗(yàn)用杜仲樹(shù)皮采購(gòu)于貴州省貴陽(yáng)市援生醫(yī)院(產(chǎn)地:四川省古藺縣),經(jīng)研磨機(jī)制成粉末后過(guò)60 目篩網(wǎng),分別稱取杜仲皮粉末0、5.0、10.0、20.0 g 以及40.0 g 分別放入1 000 ml 的蒸餾水中煮沸4 h,經(jīng)300 目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾,并將濾液濃縮至100 ml,得到水提物。將100 ml不同濃度杜仲皮水提物和300 ml 蒸餾水與1 kg 已粉碎的基礎(chǔ)飼料混勻,經(jīng)制粒機(jī)制作成直徑1 mm的顆粒飼料,風(fēng)干,保存在-20 ℃的密封塑料袋中備用。
隨機(jī)選取體質(zhì)健康,大小均勻(145.56±4.12)g的虹鱒進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)分為5個(gè)處理組,每組3個(gè)重復(fù),將15口網(wǎng)箱(規(guī)格1.0 m×1.0 m×1.2 m,有效水體積為600 L,每口網(wǎng)箱投放30尾虹鱒)分別置于3口室外流水水泥池內(nèi)(流速為0.04 m/s,水溫為12.8~14.1 ℃,溶氧濃度≥7.5 mg/l,氨氮<0.05 mg/l,pH值7.6~8.4)。在自然光照條件下,養(yǎng)殖10周,每日投喂4次,緩慢投喂(每隔5 min 投喂一次),連續(xù)投喂至飽食為準(zhǔn)。投喂時(shí)間分別為09:00、12:00、15:00和18:00。
將養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后的虹鱒饑餓24 h,每口網(wǎng)箱隨機(jī)選取2 尾,用MS-222 麻醉后迅速在冰盤(pán)上進(jìn)行解剖,取側(cè)背白肌,放入液氮罐中,-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
總RNA 的提取參照RNA simple Total RNA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后對(duì)所得總RNA 樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠檢測(cè)虹鱒肌肉組織總RNA 質(zhì)量。根據(jù)28S 和18S 的亮度及比值判斷RNA的完整性。微量核酸測(cè)定儀測(cè)量總RNA濃度以及波長(zhǎng)為260 nm和280 nm的吸光度。
使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific?)對(duì)總RAN 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。提前將無(wú)菌無(wú)RNase污染的PCR管置于冰上,按照順序加入表1 的反應(yīng)物,將模板和引物的混合液輕輕混勻,短暫離心15 s,65 ℃孵育5 min,冰上冷卻,離心15 s,再置于冰上冷卻。再按順序加入表2組分。輕輕混勻,離心15 s,放入42 ℃的水浴鍋中孵育60 min。70 ℃加熱5 min終止反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)或者在-80 ℃保存。
從NCBI中下載虹鱒MRFs基因及內(nèi)參基因β-actin 全序列,利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物(見(jiàn)表3,由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)。以虹鱒肌肉中的cDNA 為模板,用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行Real-Time PCR 反應(yīng),檢測(cè)虹鱒肌肉MRFs 轉(zhuǎn)錄水平。反應(yīng)體系見(jiàn)表4,反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃150 s;變性94 ℃15 s;退火58 ℃30 s;39循環(huán)。
表1 第一鏈cDNA合成體系(1)
表2 第一鏈cDNA合成體系(2)
表3 引物序列及擴(kuò)增片段大小
表4 反應(yīng)體系
用熒光定量PCR 方法檢測(cè)不同濃度的杜仲水提物對(duì)MRFs 基因家族表達(dá)的影響,為了進(jìn)一步清晰地表示出杜仲水提物添加組與正常對(duì)照組基因表達(dá)之間的關(guān)系,將對(duì)照組的基因表達(dá)量調(diào)整為1,用2-△△CT法計(jì)算MRFs 家族基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量,采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan's法多重檢驗(yàn)分析組間差異顯著性,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
對(duì)虹鱒肌肉總RNA 提取后,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1,圖1 中28 S 和18 S 條帶清晰可見(jiàn),且灰度值約為2:1,而5 S 帶幾乎沒(méi)有,說(shuō)明總RNA 無(wú)明顯降解。利用微量核酸測(cè)定儀測(cè)定總RNA的純度及濃度,結(jié)果顯示濃度在200 mg/μl 以上,A260 nm/A280 nm 均 在1.90~2.10 之 間,未 檢 測(cè) 到DNA及蛋白污染,說(shuō)明提取的總RNA符合試驗(yàn)要求,可用于后續(xù)RT-PCR和qPCR反應(yīng)。
圖1 虹鱒肌肉總RNA的質(zhì)量檢測(cè)
用引物對(duì)虹鱒肌肉Myf6、Myf5、MyoD、MyoG和βactin 基因進(jìn)行擴(kuò)增,PCR 產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果表明擴(kuò)增片段與預(yù)期大小一致,條帶單一且無(wú)非特異性擴(kuò)增雜帶及引物二聚體,說(shuō)明可以用于熒光定量PCR的檢測(cè)(如圖2所示)。
圖2 虹鱒肌肉Myf6、Myf5、MyoD、MyoG和β-actin基因擴(kuò)增圖
經(jīng)肌肉Myf6、Myf5、MyoD、MyoG基因和β-actin基因擴(kuò)增曲線分析,擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)“S”形,表明這五個(gè)基因動(dòng)力學(xué)曲線平行性較好,曲線拐點(diǎn)清晰,基線平行無(wú)上揚(yáng)趨勢(shì),最后進(jìn)入平臺(tái)期,表明稀釋濃度合適。經(jīng)溶解曲線分析,Myf6、Myf5、MyoD、MyoG基因和β-actin基因的溶解曲線只呈現(xiàn)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的單峰,說(shuō)明了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性良好,沒(méi)有出現(xiàn)其他的非特異性產(chǎn)物,其溶解溫度分別為86.0、88.0、87.5、84.0 ℃和87.0 ℃。
圖3 β-actin與MyoD基因擴(kuò)增曲線
圖4 β-actin與MyoG基因擴(kuò)增曲線
杜仲水提物對(duì)虹鱒肌肉Myf6、Myf5、MyoD 和MyoG 基因相對(duì)表達(dá)量影響的結(jié)果如圖11~圖14。各處理組之間肌肉Myf6、MyoD和Myf5基因表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。2.0%組肌肉MyoG基因表達(dá)量顯著高于其他各處理組,4.0%組肌肉MyoG 基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組、0.5%組和1%組(P<0.05)。
圖5 β-actin與Myf6基因擴(kuò)增曲線
圖6 β-actin與Myf5基因擴(kuò)增曲線
圖7 β-actin與Myf6基因溶解曲線
圖8 β-actin與Myf5基因溶解曲線
圖9 β-actin與MyoD基因溶解曲線
圖10 β-actin與MyoG基因溶解曲線
生肌調(diào)節(jié)因子(muscle regulatory factors,MRFs)基因家族對(duì)肌肉的調(diào)控作用主要體現(xiàn)在對(duì)肌細(xì)胞命運(yùn)的決定,成肌細(xì)胞增殖和分化、肌纖維的形成等方面。MRFs基因家族是1987年由Davis等首次發(fā)現(xiàn)[20],而后Braun等[21]和Tapscott 等[22]根據(jù)人與小鼠MyoD的同源性,于1989年從人類胎盤(pán)的骨骼肌cDNA文庫(kù)中分離得出(myogenic determining factor,MyoD)、生肌因子5(myogenic factor 5,Myf5)、肌細(xì)胞生成素(myogenin,MyoG)和生肌因子6(myogenic factor 6,Myf6),它們是控制骨骼肌生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,共同控制肌肉的生成[23]。
圖11 杜仲水提物對(duì)虹鱒肌肉Myf5 mRNA表達(dá)的影響
圖12 杜仲水提物對(duì)虹鱒肌肉Myf6 mRNA表達(dá)的影響
圖13 杜仲水提物對(duì)虹鱒肌肉MyoD mRNA表達(dá)的影響
圖14 杜仲水提物對(duì)虹鱒肌肉MyoG mRNA表達(dá)的影響
本研究發(fā)現(xiàn)2.0%和4.0%組的MyoG mRNA 表達(dá)顯著高于對(duì)照組。MyoG 作為骨骼肌分化所必需的因子,它是MRFs 基因家族中唯一能夠在所有骨骼肌細(xì)胞中均表達(dá)的基因,且在肌細(xì)胞的形成過(guò)程中具有中心調(diào)控作用,它與肌纖維的直徑、大小、數(shù)量以及密度密切相關(guān)[24]。MyoG 基因通過(guò)控制成肌細(xì)胞的融合和肌纖維的形成來(lái)對(duì)肌肉的分化作用產(chǎn)生影響,其對(duì)脊椎動(dòng)物肌細(xì)胞分化和骨骼肌系統(tǒng)的發(fā)育成熟具有重要意義[25]。Hasty 等[26]的研究表明,MyoG基因敲除的小鼠出生后會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的骨骼肌發(fā)育缺陷,說(shuō)明該基因?qū)趋兰〉男纬捎兄匾淖饔?。MyoG 基因可以調(diào)節(jié)自身表達(dá),也可以與其他成員相互作用,彼此調(diào)節(jié)。當(dāng)胚胎干細(xì)胞中缺失MyoG 時(shí)完全分化的肌纖維由過(guò)量表達(dá)的Myf6 產(chǎn)生[27]。但是,MyoG 調(diào)控著中胚層細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞,再由成肌細(xì)胞融合為肌纖維[28],這是一個(gè)不可替代過(guò)程。本研究還發(fā)現(xiàn)各組之間Myf5、MyoD 和Myf6 mRNA 表達(dá)量無(wú)顯著差異,但2.0%和4.0%組Myf6 mRNA 的表達(dá)量變高于對(duì)照組,這一變化趨勢(shì)與MyoG 基因變化相似。根據(jù)結(jié)構(gòu)及功能的不同,將MRFs 基因家族分為兩類,初級(jí)MRFs 和次級(jí)MRFs。初級(jí)MRFs 主要指Myf5 和MyoD,兩者同源性較高,且在成肌分化中兩基因在功能上存在互補(bǔ)。當(dāng)阻隔MyoD 表達(dá)時(shí)Myf5會(huì)發(fā)生代償性高表達(dá),骨骼肌仍能發(fā)育;當(dāng)阻隔Myf5 的表達(dá),則不能生成早期的肌節(jié),但隨后MyoD會(huì)被激活而表達(dá),肌肉仍可形成;若Myf5 和MyoD 均缺失,則無(wú)前體成肌細(xì)胞生成,個(gè)體將無(wú)法產(chǎn)生肌肉[29]。次級(jí)MRFs 為MyoG 和Myf6(MRF4)。它們?cè)贛yf5和MyoD 的下游表達(dá),在肌細(xì)胞的終末分化以及肌纖維成熟及維持方面起作用[30-31]。若缺乏MyoG,則無(wú)肌纖維形成;若缺乏Myf6,個(gè)體雖能夠形成骨骼肌,但會(huì)因?yàn)槔吖前l(fā)育缺陷,在出生時(shí)就死亡[32]。有研究表明MyoG 基因主要在胚胎骨骼肌發(fā)育階段調(diào)控肌管的形成方面有重要作用,而Myf6 則是促進(jìn)肌纖維的形成以及與肌肉的分化狀態(tài)有關(guān)[33],兩者之間具有是相輔相成,相互促進(jìn)的作用。本研究中2.0%和4.0%組的Myf6 和MyoG mRNA 的表達(dá)均高于對(duì)照組,可能是由于Myf6 和MyoG 基因相互促進(jìn)作用而引起的。
飼料中添加杜仲水提物對(duì)虹鱒肌肉MyoD、Myf6和Myf6 mRNA 表達(dá)無(wú)顯著影響,但添加2.0%和4.0%的杜仲水提物可以顯著提高虹鱒肌肉MyoG基因表達(dá)量。杜仲皮水提物可通過(guò)調(diào)控虹鱒肌肉MyoG基因的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)肉質(zhì)改善。