■唐 彧 張瓊瓊 郭永鵬 鄭雅文 趙麗紅

(動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京100193)

霉菌毒素是霉菌生長過程中所產(chǎn)生的有毒次級 代謝產(chǎn)物，其具有致突變性、致畸性和細(xì)胞毒性，對動物和人類健康有極大危害，并可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。其中，危害較大的兩種霉菌毒素為黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）與玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）。黃曲霉毒素毒性最強且分布最廣，具有高致病性和較強致癌性，可直接或間接影響人的食品安全。ZEN具有較強的生殖毒性，可造成動物急慢性中毒，并通過食物鏈嚴(yán)重威脅人類身體健康。研發(fā)糧食與飼料中霉菌毒素的脫毒技術(shù)，對于改善動物生產(chǎn)性能、提高動物產(chǎn)品品質(zhì)、保障食品安全有著重要意義[1-3]。

當(dāng)前，對于霉菌毒素的脫毒方法有物理、化學(xué)及生物法。其中物理法包括原料稀釋法、高溫處理法等；化學(xué)法有堿處理、氧化處理等；生物法有酶降解法和微生物脫毒法。物理與化學(xué)法對霉菌毒素的降解效率較低且可能降低飼料營養(yǎng)價值，生物脫毒法可生成無毒或低毒降解產(chǎn)物，且多為專一性降解，不會破壞飼料中其他營養(yǎng)物質(zhì)，是霉菌毒素脫毒的重要方法[4-5]。國內(nèi)外關(guān)于霉菌毒素的生物降解已有諸多研究。Samuel 等[6]分離出一株假單胞菌（Pseudomonas），通過對其降解能力及降解產(chǎn)物的研究，發(fā)現(xiàn)該菌株在液體培養(yǎng)基中對0.2 μg/ml 的ZEN 降解率達(dá)到90%以上，且其降解產(chǎn)物無毒。Cho等[7]分離出一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其在液體培養(yǎng)基中對1 mg/kg ZEN的降解率高達(dá)99%，在固體培養(yǎng)基中對0.25 mg/kg ZEN 的降解率可達(dá)95%。Harkai 等[8]對124 株鏈霉菌（Streptomyces）降解AFB1和ZEN 的能力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其中1 株鏈霉菌對AFB1降解率為88%，2 株鏈霉菌對ZEN降解率幾乎可達(dá)100%。

現(xiàn)今已知的有效降解菌株多用于降解單一毒素，關(guān)于同時降解多種霉菌毒素的菌株鮮有報道。但實際上谷物中往往是多種霉菌毒素聯(lián)合污染，其聯(lián)合污染使得霉菌毒素間可能出現(xiàn)聯(lián)合毒性作用，從而導(dǎo)致毒性更強[9-10]。因此，相比只降解單一毒素的菌株，篩選可同時降解多種霉菌毒素的菌株將具有更好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

采集自北京市郊的土壤、雞腸道食糜、驢腸道食糜等多個來源的混合樣本。

1.1.2 主要試劑和儀器

玉米赤霉烯酮與黃曲霉毒素B1、0.22 μm濾膜（Millipore）、細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒（莊盟生物）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Tiangen）、革蘭氏染液試劑盒（Aobox）、PCR儀T-100（Bio-Rad）、高效液相色譜RF-20A（Shimadeu），凝膠成像分析系統(tǒng)Universal HoodⅡ（Bio-Rad），高速冷凍離心機3K15（Sigma），電泳系統(tǒng)Powerpac（Bio-Rad），pH 計seven Compact（Meetlertoledo），恒溫震蕩培養(yǎng)箱HZQ-X100（蘇州培英）。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1 000 ml，調(diào)pH 值至7.0。121 ℃下蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉15 g。

1.2 菌株的富集、分離與篩選

稱取2.5 g 樣品放入裝有25 ml PBS 溶液的三角瓶中，搖瓶后靜置。取1 ml上清液，加入9 ml PBS，梯度稀釋至1×10-7。每個梯度各取100 μl 涂布于LB 固體培養(yǎng)基上，同時設(shè)置3 個平行，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后分離單株并編號。

將分離所得菌株分別接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，得到各菌株發(fā)酵液。取分離后不同菌株的發(fā)酵液各980 μl，分別加入20 μl ZEN 或AFB1儲備液，使ZEN、AFB1終濃度分別為2、0.4 μg/ml，置于37 ℃、180 r/min 恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)，反應(yīng)72 h。同時以未接種且含有相同ZEN或AFB1濃度的LB培養(yǎng)基為對照。

1.3 菌株對ZEN與AFB1降解率測定

取待測樣品，加入等體積甲醇，震蕩混合后靜置以充分浸提。于4 ℃、12 000 r/min條件下離心3 min，取其上清液過0.22 μm 濾膜，采用高效液相色譜（HPLC）檢測。對照組做同樣處理。

檢測條件：采用Eclipse Plus C18 液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent）；檢測AFB1時，流動相為45%甲醇+55%水（V/V），檢測器的激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為440 nm；檢測ZEN 時，流動相采用46%乙腈+46%水+8%甲醇（V/V），檢測器的激發(fā)波長為274 nm，發(fā)射波長為440 nm；檢測二者時，流速均為1.0 ml/min，進(jìn)樣量均為20 μl，柱溫均為35 ℃。

采用下列公式計算ZEN和AFB1降解率：

所有數(shù)據(jù)均重復(fù)三次取平均值，并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”繪圖。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

采用平板劃線法將降解菌接種于LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)；將分離純化的菌株406進(jìn)行革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，對菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取406菌株DNA，以此為模板擴增其16S rDNA序列。采用引物為通用引物，上游引物為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），下游引物為1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），50 μl反應(yīng)體系中含有模板1 μl，引物27F和1492R（10 μmol/l）各2 μl，2×Premix-Taq 25 μl，ddH2O 20 μl。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變形30 s，53 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)后于72 ℃延伸10 min。通過1%(M/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。利用凝膠成像分析系統(tǒng)Universal HoodⅡ檢測電泳結(jié)果，采用無菌手術(shù)刀切割目標(biāo)條帶，通過瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收，并送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中，利用BLAST程序搜索同源序列，以Clustal X軟件進(jìn)行多重序列比對，再用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[11-12]。

1.5 菌株406中ZEN與AFB1降解物質(zhì)的定位、定性

1.5.1 發(fā)酵液、上清液及菌懸液的制備

將菌株406 于LB 液體培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，得到發(fā)酵液。取發(fā)酵液10 ml 于4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，上清液過0.22 μm濾膜，獲得無細(xì)胞上清液，于4 ℃保存?zhèn)溆?；下層菌體細(xì)胞用PBS 溶液重新懸浮，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，重復(fù)3次，沖洗3次后用PBS溶液重新懸浮至10 ml，振蕩混勻，即為菌懸液。

1.5.2 降解ZEN或AFB1的物質(zhì)來源定位

將上述所得的發(fā)酵液、上清液及菌懸液各980 μl，向其中分別加入20 μl霉菌毒素，使ZEN、AFB1終濃度分別為2、0.4 μg/ml。將反應(yīng)體系置于37 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床上孵育，以上試驗均設(shè)置3 個重復(fù)，分別于12、24、36、48、72 h和96 h取樣，用高效液相色譜檢測各毒素殘留量，以推測降解ZEN 與AFB1的活性物質(zhì)位于發(fā)酵液、上清液還是菌懸液。

1.5.3 降解物質(zhì)的定性

根據(jù)上述試驗結(jié)果，取10 ml發(fā)酵上清液，分別給予以下處理：95 ℃水浴10 min 后冷卻至室溫；煮沸10 min后冷卻至室溫；加入0.1 g胰蛋白酶（即10 mg/ml胰蛋白酶）充分溶解并混勻；加入十二烷基硫酸鈉0.5 g（即5% SDS）充分溶解并混勻。取處理后的樣品分別與ZEN 或AFB1共培養(yǎng)，每個樣品做3 個重復(fù)，于37 ℃、180 r/min 條件下進(jìn)行降解試驗，設(shè)置空白對照，72 h后用高效液相色譜檢測各毒素殘留量。

1.6 分離所得菌株對ZEN和AFB1的降解條件優(yōu)化

1.6.1 溫度對406降解菌降解效果影響

向980 μl 上清液中分別加入20 μl 霉菌毒素，使ZEN、AFB1終濃度分別為2、0.4 μg/ml；以pH值與上清液相同的LB 培養(yǎng)基為空白對照，分別在37、47、57、67 ℃和77 ℃的水浴鍋中孵育，72 h 后取樣，采用HPLC檢測霉菌毒素殘留量。

1.6.2 pH值對406降解菌降解效果影響

以5 mol/l NaOH 或5 mol/l HCl 分別調(diào)節(jié)上清液的初始pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，向980 μl調(diào)節(jié)pH值后的上清液中加入20 μl霉菌毒素，使ZEN、AFB1終濃度分別為2、0.4 μg/ml；以相同pH值的LB培養(yǎng)基為空白對照，置于37 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床中孵育，72 h后取樣，采用HPLC檢測霉菌毒素的殘留量。

2 結(jié)果

2.1 ZEN與AFB1降解菌的篩選鑒定

從多個不同來源的混合樣本中經(jīng)分離純化獲得279 株不同菌株，篩選后獲得9 株可同時降解ZEN 和AFB1的菌株，其中菌株406對兩種霉菌毒素的降解能力最強，其發(fā)酵液對ZEN 和AFB1的降解率分別為50%和54%，選擇此菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1 篩選所得的9株菌株對ZEN和AFB1的降解率

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

在LB 固體培養(yǎng)基上菌株的生長情況如圖2a 所示，菌落呈淡黃色圓形，直徑1 mm左右，中間隆起，表面濕潤光滑有光澤，邊緣整齊且成半透明狀。通過革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體形態(tài)如圖2b 所示，該菌株為革蘭氏陽性菌，形態(tài)呈短桿狀，有時微彎曲，兩端鈍圓，不分枝，單個或成八字排列。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)PCR 擴增后，菌株406 的16S rDNA 片段長度約為1 177 bp，在GenBank 的序列登錄號/注冊號為lcl|Query_166539，經(jīng)過BLAST比對發(fā)現(xiàn)該菌株與谷氨酸棒狀桿菌的同源性達(dá)到99%。使用Clustal X（版本號）與MEGA-X（版本號）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與BLAST比對，可以確定菌株406屬于谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamate）。

圖2 菌株形態(tài)圖

2.3 谷氨酸棒狀桿菌406降解ZEN與AFB1的活性物質(zhì)定位

谷氨酸棒狀桿菌406 中發(fā)酵液、上清液及菌懸液對ZEN 或AFB1的降解率隨時間變化情況如圖4、圖5 所示。菌株406 的發(fā)酵液、上清液及菌懸液分別與ZEN 共培養(yǎng)96 h 后，對該毒素的降解率分別為54%、50%、13%（圖4）。菌株406 的發(fā)酵液、上清液及菌懸液分別與AFB1共培養(yǎng)96 h 后，對該毒素的降解率分別為52%、58%、16%（圖5）。由此可推斷菌株406 降解ZEN 與AFB1的活性物質(zhì)存在于上清液，表明菌株406 降解ZEN 和AFB1不是依賴菌體的吸附作用，而是由胞外的活性物質(zhì)主導(dǎo)的生物降解作用。

圖3 以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的降解菌406系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 谷氨酸棒狀桿菌406菌液組分對ZEN降解率的影響

圖5 谷氨酸棒狀桿菌406菌液組分對AFB1降解率的影響

2.4 谷氨酸棒狀桿菌406降解ZEN與AFB1的胞外物質(zhì)定性

為了進(jìn)一步判斷谷氨酸棒狀桿菌406 降解ZEN與AFB1的胞外物質(zhì)的性質(zhì)，給予菌株406上清液四種不同的處理，并考察處理后的上清液對ZEN 與AFB1的降解效果。經(jīng)過高效液相色譜法檢測發(fā)現(xiàn)（圖6），經(jīng)95 ℃水浴10 min 和煮沸10 min 處理的上清液對ZEN和AFB1的降解能力小幅提高；經(jīng)5% SDS處理的上清液對ZEN 和AFB1的降解能力顯著降低；經(jīng)胰蛋白酶處理的上清液對ZEN和AFB1的降解能力影響不明顯。熱處理通常可以破壞DNA、維生素和大部分蛋白（酶）的空間結(jié)構(gòu)，但菌株406上清液中的降解活性物質(zhì)對熱的耐受能力較強，較短時間熱處理并未對其造成明顯影響；SDS 作為變性劑，能破壞蛋白的空間結(jié)構(gòu)，經(jīng)5% SDS 處理，上清液對ZEN 和AFB1的降解能力顯著降低，因此可以初步推斷菌株406分泌的降解活性物質(zhì)是蛋白類。

2.5 谷氨酸棒狀桿菌406降解ZEN與AFB1的溫度和pH值條件

2.5.1 pH值對谷氨酸棒狀桿菌406降解效果的影響

如圖所示（圖7），谷氨酸棒狀桿菌406的上清液在37～77 ℃之間對ZEN與AFB1均有較好降解效果，降解率均為40%以上；該菌株的最佳降解溫度為67 ℃，此時其對ZEN與AFB1的降解率分別為89%、85%。

圖6 熱、SDS、胰蛋白酶處理對谷氨酸棒狀桿菌406上清液降解ZEN和AFB1的影響

圖7 溫度對谷氨酸棒狀桿菌406上清液降解ZEN和AFB1的影響

2.5.2 pH 值對谷氨酸棒狀桿菌406 菌株降解毒素效果的影響(見圖8)

圖8 pH值對谷氨酸棒狀桿菌406上清液降解率ZEN和AFB1的影響

由圖8可知，該菌株上清液中的降解活性物質(zhì)在pH 值5～9 范圍內(nèi)均可發(fā)揮降解作用，在pH 值7～8 時的降解效果最好，此時ZEN 與AFB1的降解率分別為51%、58%；隨著pH 值升高或降低，降解率也逐漸降低，但是pH值升高對降解率的影響小于pH值降低對降解率的影響，由此可推測該菌適宜在中性或微堿性環(huán)境中生長。

3 討論

霉菌毒素分布廣、毒性強、物理化學(xué)方法去毒效果不理想已成為保障飼料安全的限制因素，因此篩選和發(fā)掘可高效降解霉菌毒素的微生物已成為當(dāng)今研究熱點。但是目前已報道的菌株多致力于降解單一毒素，在應(yīng)對霉菌毒素聯(lián)合污染時有一定局限性。本研究篩選出一株可同時降解ZEN和AFB1兩種霉菌毒素的菌株406，經(jīng)過16S rDNA鑒定確定為谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamate），這是首次發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌可同時降解ZEN和AFB1。谷氨酸棒狀桿菌已應(yīng)用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，其可利用葡萄糖、乙酸等為唯一碳源，產(chǎn)生氨基酸、有機酸、維生素等[13]，也可用于降解有毒酚類芳香族化合物(阿魏酸、香草醛、苯酚、間苯二酚等)[14]。ZEN 中含有一個雙酚基團，AFB1是一種多芳香族化合物，谷氨酸棒狀桿菌406降解這兩種毒素的方式很可能與降解酚類芳香族化合物的方式相似。

將毒素分別與發(fā)酵液、菌懸液、上清液共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)上清液即胞外物質(zhì)對ZEN和AFB1表現(xiàn)出較強的降解活性，且其降解能力強于菌懸液和發(fā)酵液。在Shu等[15]篩選到的維氏桿菌DY3108、Guan 等[17]篩選到的橙色黏球菌及Sangare 等[16]篩選到的銅綠假單胞菌N17-1中。谷氨酸棒狀桿菌406對兩種霉菌毒素的作用是由胞外活性物質(zhì)發(fā)揮的降解作用，而不是基于細(xì)胞壁的吸附作用。

將谷氨酸棒狀桿菌406 的上清液于95 ℃水浴10 min 或煮沸10 min 后，發(fā)現(xiàn)其對ZEN 和AFB1的降解能力有所提高，表明谷氨酸棒狀桿菌406有較好的熱穩(wěn)定性，這使該菌株在實際生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用價值。在其他AFB1降解菌中也觀察到了類似現(xiàn)象，Sangare 等[16]曾報道對銅綠假單胞菌N17-1 的無細(xì)胞上清液進(jìn)行沸水浴10 min處理，在熱活化作用的刺激下其對AFB1的降解活性提高了3.49%。Wang 等[18]發(fā)現(xiàn)煮沸10 min后鐮刀菌WCQ3361的代謝產(chǎn)物仍保持99.4% AFB1降解活性。經(jīng)SDS處理后，上清液對兩種霉菌毒素的降解能力幾乎完全被破壞，表明谷氨酸棒狀桿菌406 的胞外物質(zhì)對SDS 處理敏感，在橙色黏球菌ANSM068、維氏桿菌DY3108等其他黃曲霉毒素降解菌中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果[15，17]，Guan 等[17]推測有蛋白質(zhì)或酶參與了AFB1的生物降解，并通過色譜法、離子交換柱層析等方法證實其降解活性組分為蛋白質(zhì)。由此推測可能有蛋白類或酶類物質(zhì)參與兩種毒素的降解。但是經(jīng)胰蛋白酶處理，谷氨酸棒狀桿菌406的上清液對兩種毒素的降解能力僅略有降低，這與上述推測的有蛋白類或酶類物質(zhì)參與反應(yīng)不符。Cuccioloni 等[19]的研究通過分析AFB1與胰蛋白酶之間相互作用的動力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)AFB1可與胰蛋白酶發(fā)生可逆結(jié)合，從而使胰蛋白酶催化反應(yīng)的能力降低。初步推測由于AFB1與胰蛋白酶進(jìn)行結(jié)合，導(dǎo)致胰蛋白酶催化反應(yīng)能力降低，從而限制胰蛋白酶與菌株406上清液中活性物質(zhì)作用，對其降解能力沒有顯著性影響。

通過對降解條件的優(yōu)化確定谷氨酸棒狀桿菌406的上清液對ZEN 與AFB1的最佳降解pH 值為8、最佳降解溫度為67 ℃。酶促反應(yīng)體系中，酶在最適pH值或最適溫度下活性最高，菌株406的上清液在對ZEN和AFB1的降解中表現(xiàn)出這一特性，結(jié)合SDS 對上清液的處理結(jié)果，進(jìn)一步推測降解活性物質(zhì)為一種細(xì)菌所產(chǎn)胞外酶。此外，值得注意的是谷氨酸棒狀桿菌406 對兩種霉菌毒素在37 ℃仍具有50%以上的降解率，可用于實際生產(chǎn)中兩種毒素污染飼料和糧食的生物脫毒。

4 結(jié)論

目前，有關(guān)于生物降解多種霉菌毒素的研究還很少，本研究篩選出的谷氨酸棒狀桿菌406可同時降解ZEN 和AFB1兩種霉菌毒素，為食品和飼料中兩種毒素的生物降解提供了新的菌種資源。