■譚敬儀 曹志勇 黃 偉 熊思然 鄭 躍 余開(kāi)文 陶琳麗，3 楊秀娟，3*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與信息工程學(xué)院，云南昆明650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201）

我國(guó)是世界上大豆生產(chǎn)量最大的國(guó)家之一，大豆的資源非常豐富。其中豆粕蛋白含量一般在40%～50%之間，豆粕在飼料中的應(yīng)用方法主要有：一是作為蛋白原料直接添加，二是酶解豆粕和發(fā)酵豆粕，即利用現(xiàn)代生物技術(shù)將大豆蛋白通過(guò)蛋白酶酶解或微生物發(fā)酵降解為可溶性蛋白和小分子多肽的混合物。然而，在20世紀(jì)70年代，研究發(fā)現(xiàn)含2個(gè)和3個(gè)氨基酸的小肽是蛋白質(zhì)水解的主要產(chǎn)物，含2或3個(gè)氨基酸殘基的小肽可以通過(guò)載體直接被吸收。許多試驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)在降解為氨基酸的過(guò)程中產(chǎn)生的中間體小肽可被動(dòng)物體直接吸收。而蛋白質(zhì)的水解方法有三種，分別是化學(xué)水解法、酶水解法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)水解法分為酸水解法和堿水解法兩種水解方法，其優(yōu)點(diǎn)就是水解的工藝流程簡(jiǎn)單、成本低廉、酸和堿容易購(gòu)買、操作簡(jiǎn)單。本試驗(yàn)以豆粕為原料，探索鹽酸水解方法制備2～3個(gè)氨基酸組成的小肽的工藝條件，并通過(guò)正交試驗(yàn)以期獲得最優(yōu)水解工藝條件，為豆粕的深加工利用研制出一種既營(yíng)養(yǎng)豐富，又安全可靠的小肽產(chǎn)品，為今后豆粕深加工和綜合利用提供科學(xué)的方法和依據(jù)供參考。

1 材料與方法

1.1 豆粕

購(gòu)至金田園飼料有限公司，進(jìn)行粉碎后供水解使用。

1.2 試驗(yàn)儀器

半自動(dòng)凱氏定氮儀(SKD-1000)，上海沛歐分析儀器有限公司。pH計(jì)（pHS-3D），上海精密科學(xué)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)FD-1C-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試劑

中性甲醛溶液（36%）：應(yīng)不含有聚合物，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH值為7.0。

0.1 mol/l硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液。

1.4 方法

試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)水解時(shí)間（4、6、8 h）、鹽酸濃度（2、4、6 mol/l）、料液比（1:4、1:5、1:6）三個(gè)因素三個(gè)水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共9組，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L9（33）

式中：氨基態(tài)氮采用甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定；

總氮含量采用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

從理論計(jì)算，當(dāng)水解液中的水解度為30%～50%之間時(shí)，可得到豆粕飼料小肽。

1.4.1 樣品制備

取(1.50±0.01) g 豆粕于水解管中，按表1 中添加不同濃度、不同的體積的酸溶液，抽真空后用噴燈將水解管管口封嚴(yán)，置于(110±1) ℃烘箱中水解不同的時(shí)間。取出水解管，待其冷卻后切開(kāi)，用定性濾紙過(guò)濾至25 ml容量瓶?jī)?nèi)，定容至刻度。

1.4.2 總氨基態(tài)氮的測(cè)定

采用甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定，吸取5 ml 水解液，加50 ml水，置于100 ml燒杯中開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 mol/l）滴定至酸度計(jì)指示pH 值8.2，加入10.0 ml中性甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 mol/l）繼續(xù)滴定至pH值9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.05 mol/l)的毫升數(shù)。試樣中氨基態(tài)氮的含量按下式進(jìn)行計(jì)算。

式中：X——試樣中氨基態(tài)氮的含量（g/ml）；

V1——測(cè)定試樣加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（ml）；

V2——空白試樣加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（ml）；

V3——試樣取用量（ml）；

c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度（mol/l）；

0.014——與1.00 ml 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(1.00 mol/l)相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量(g)。

1.4.3 總氮含量的測(cè)定

采用全量凱氏定氮法，吸取5 ml水解液到消化管底部（不要黏在管壁內(nèi)），加入0.4 g 無(wú)水硫酸銅、6 g無(wú)水硫酸鉀和10 ml 濃硫酸。 將上一步中的消化管放上小漏斗置于通風(fēng)櫥中電爐上加熱消化，開(kāi)始溫度為150 ℃30 min，后調(diào)為250 ℃30 min，350 ℃1 h，380 ℃1 h，當(dāng)消化液變?yōu)楹稚珪r(shí)將消化管取下冷卻，消化到顏色由淡黃色變成透明的藍(lán)綠色并無(wú)黑色雜質(zhì)時(shí)。停止消化，待消化管在消化爐中冷卻到室溫時(shí)，取下消化管并加入少量的蒸餾水。接著用全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行蒸餾，在蒸餾結(jié)束后的硼酸吸收液中滴加1～2 滴甲基紅-溴甲酚綠指示劑，用0.1 mol/l 的硫酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定，當(dāng)溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色為滴定終點(diǎn)，并記下滴定終點(diǎn)時(shí)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的使用量。

原料中的總氮含量計(jì)算公式如下：

式中：X——試樣中總氮含量（g/ml）；

V1——滴定試樣時(shí)所消耗的硫酸體積(ml）；

V2——滴定空白試樣時(shí)所消耗的硫酸體積(ml）;

V3——試樣取用量(ml）；

c——硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度（mol/l）；

0.014——與1.00 ml硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(1.00 mol/l)相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量（g）。

每個(gè)容量瓶做2個(gè)平行測(cè)定，以其算數(shù)平均值為結(jié)果。

1.4.4 平均肽鏈長(zhǎng)度（APL）測(cè)定

需要測(cè)定α-氨基氮含量和總氮（T）含量。用甲醛滴定法測(cè)定α-NH2-N 含量，總氮用凱氏定氮法測(cè)定。然后計(jì)算平均肽鏈長(zhǎng)度，公式如下：

平均肽鏈長(zhǎng)度(APL)=總氮含量/α-氨基氮含量

1.4.5 肽分子平均相對(duì)分子質(zhì)量（PMW）

肽分子平均相對(duì)分子質(zhì)量(PMW)計(jì)算公式：

PMW=肽分子平均鏈長(zhǎng)（PCL）×氨基酸平均相對(duì)分子質(zhì)量(氨基酸平均相對(duì)分子質(zhì)量為120)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水解條件對(duì)豆粕水解度的影響

按照1.4 方法中的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)豆粕進(jìn)行水解，分別測(cè)定水解液中的氨基態(tài)氮、總氮，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同水解工藝水解結(jié)果比較分析

從表2中可以看出，水解條件對(duì)各處理組間的氮水解回收率、氨基態(tài)氮、總氮和水解度影響存在一定的差異，從氮水解回收率看，處理1與其余8個(gè)處理間差異顯著（P＜0.05），處理2、4與處理7間差異不顯著（P＞0.05），處理3、4、5、6、7、8 與處理9 間差異不顯著（P＞0.05）；而氨基態(tài)氮結(jié)果中，處理1、2、3、8分別與其余各處理間差異顯著（P＜0.05），處理4與處理7間，處理5、6與處理9間差異不顯著（P＞0.05）；從總氮中可以看出，處理1、5與其余各組間差異顯著（P＜0.05），處理2、3、4、6、7、8 和處理9 間差異不顯著（P＞0.05）；從水解度看，處理1、6、9與其余各處理間差異顯著（P＜0.05），處理2與處理5間差異不顯著（P＞0.05），與其余各處理差異顯著（P＜0.05），處理3、7、8間差異不顯著（P＞0.05），處理4、7、8間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同水解條件對(duì)豆粕小肽平均肽鏈長(zhǎng)度和小肽平均分子量的影響（見(jiàn)表3）

從表3可以看出，水解條件對(duì)各處理間平均肽鏈長(zhǎng)度（APL）、肽分子平均相對(duì)分子質(zhì)量（PMW）有差異，并且都呈現(xiàn)了相同的趨勢(shì)，處理1、2、5與其余各處理間APL、PMW均差異顯著（P＜0.05）；處理3、7與處理8間差異不顯著（P＞0.05），與其余各處理間差異顯著（P＜0.05）；處理4、7與處理8間不顯著（P＞0.05），與其余各處理間差異顯著（P＜0.05）；處理6、9間差異不顯著（P＞0.05），與其余各處理間差異顯著（P＜0.05）。

表3 豆粕小肽平均肽鏈長(zhǎng)度和小肽平均分子量比較分析

小肽是指由2～3 個(gè)氨基酸組成的寡肽，從表3 可以看出，處理1、2、5 的平均肽鏈長(zhǎng)度（APL）在2～3 個(gè)氨基酸殘基之間，滿足豆粕小肽所需的肽鏈長(zhǎng)度，其余6 個(gè)處理均小于2 個(gè)氨基酸殘基，不滿足豆粕小肽所需的肽鏈長(zhǎng)度，但是處理5的氮水解回收率顯著高于處理1和處理2（P＜0.05），所以處理5的水解工藝條件要優(yōu)于處理1和處理2，即當(dāng)鹽酸濃度為3 mol/l，料液比為1:5，水解5 h 的水解工藝條件下，此時(shí)平均鏈長(zhǎng)為2.14 個(gè)氨基酸殘基，能達(dá)到小肽要求的平均肽鏈長(zhǎng)度，即豆粕水解為小肽。

2.3 不同工藝條件對(duì)各指標(biāo)影響的主效應(yīng)分析

為了比較不同水解條件對(duì)氨基態(tài)氮含量、總氮含量、水解度、氮水解回收率、平均肽鏈長(zhǎng)度、肽平均分子量等因素的影響的主次順序，采用極差方法，以極差值大小確定各因素的影響主次順序，結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4中可以看出，水解時(shí)間、鹽酸濃度、料液比三個(gè)水解條件對(duì)水解度、平均肽鏈長(zhǎng)度、肽平均分子量、總氮四個(gè)指標(biāo)的影響主效應(yīng)是一樣的，即鹽酸濃度＞水解時(shí)間＞料液比；水解時(shí)間、鹽酸濃度、料液比三個(gè)水解條件對(duì)氨基態(tài)氮指標(biāo)的影響主效應(yīng)即為料液比＞水解時(shí)間＞鹽酸濃度；水解時(shí)間、鹽酸濃度、料液比三個(gè)水解條件對(duì)氮回收率指標(biāo)的影響主效應(yīng)即為水解時(shí)間＞鹽酸濃度＞料液比。極差越大說(shuō)明該因素的影響也就越大。

3 討論

本試驗(yàn)研究中所設(shè)計(jì)的水解時(shí)間、鹽酸濃度和料液比三個(gè)水解條件中，三個(gè)條件都是影響試驗(yàn)指標(biāo)的重要因素，其中鹽酸濃度是影響試驗(yàn)指標(biāo)的主要因素。陳曉剛等（2011）采用響應(yīng)面分析法對(duì)酸水解制備波紋巴非蛤小分子肽工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的最優(yōu)酸水解條件為：固液質(zhì)量比1:3、鹽酸濃度6.4 mol/l、酸水解溫度92 ℃、酸水解時(shí)間5.3 h，在此條件下肽得率為82.21%，與鹽酸濃度固定為6 mol/l 的條件下，隨著酸水解溫度的升高，肽得率呈先上升后下降的趨勢(shì)，主要是因?yàn)闇囟冗^(guò)高，小分子肽開(kāi)始大量地進(jìn)一步分解為游離氨基酸，導(dǎo)致肽得率下降。在最優(yōu)工藝條件下，肽得率可達(dá)到82.21%。喬偉等（2006）酸水解制備飼料小肽的初步研究中提出本試驗(yàn)結(jié)果表明：溫度和時(shí)間對(duì)酸水解程度有較大影響，其中溫度的影響更大。適合的水解條件為反應(yīng)溫度90 ℃。反應(yīng)時(shí)間5 h，終產(chǎn)物二肽、三肽含量為19.38%。喬偉等（2006）著重從酸解中的溫度因素分析蛋白質(zhì)水解程度。本試驗(yàn)結(jié)果表明的最優(yōu)豆粕蛋白水解條件為水解時(shí)間為4 h、鹽酸濃度為3 mol/l、料液比為1:4。試驗(yàn)結(jié)果表明的最優(yōu)豆粕蛋白水解條件為水解時(shí)間為5 h、鹽酸濃度為3 mol/l、料液比為1:5，造成差異的原因可能是本試驗(yàn)采用的時(shí)間與鹽酸濃度不同造成試驗(yàn)結(jié)果有所差異。

表4 影響各指標(biāo)的主效應(yīng)分析

4 結(jié)論

水解時(shí)間、鹽酸濃度、料液比三個(gè)水解條件都是影響游離態(tài)氮、總氮和氨基態(tài)氮、水解度的主要因素，其中鹽酸濃度是影響試驗(yàn)指標(biāo)的主要因素。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)得到的結(jié)論如下：水解豆粕的最優(yōu)水解工藝條件為當(dāng)豆粕水解小肽水解時(shí)間為5 h、鹽酸濃度為3 mol/l、料液比為1:5時(shí)水解度在30%～50%，達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?～3個(gè)氨基酸殘基的大豆小肽，氮回收率達(dá)到79.59%。