吳兆圓，方 偉，張志剛，張亞妮，萬(wàn)中義，王開梅

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064

自農(nóng)業(yè)起源以來(lái)，雜草一直是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的主要生物因素，能夠?qū)е?0%～90%的作物產(chǎn)量損失[1]。天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)多樣、環(huán)境友好等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最具有前景的農(nóng)藥活性先導(dǎo)的來(lái)源[2]。真菌能產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)了許多具有除草活性的天然化合物[3]。如由病原真菌Phomamacrostoma產(chǎn)生的Macroeidin A，是一種吡咯酸化合物，已經(jīng)申請(qǐng)專利作為除草劑使用[4]。從內(nèi)臍蠕孢屬真菌Drechsleraaustraliensis的發(fā)酵液中得到Holadysenterine，試驗(yàn)研究表明其對(duì)多種雜草的除草活性與合成除草劑2,4-D相當(dāng)[5]。從植物病原菌Cochliobolusaustraliensis中分離得到Chloromonilinic acids C和D能明顯抑制美洲蒺藜草的胚根生長(zhǎng)[6]。

本課題組在真菌源農(nóng)藥活性天然產(chǎn)物的篩選過程中，得到一株具有除草活性的真菌NBERC_49006，經(jīng)鑒定為粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum)，其乙酸乙酯提取物對(duì)擬南芥(Arabidopsisthaliana)表現(xiàn)出較好的除草活性。對(duì)菌株進(jìn)行大量發(fā)酵、提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定，得到2個(gè)倍半萜類化合物：trichothecin (1)和8-deoxy-trichothecin (2)，5個(gè)二萜類化合物：engleromycenolic acid A(3)、engleromycenolic acid B(4)、rosololactone(5)、rosenonolactone(6)、2α-hydroxy-cis-communic acid(7)。對(duì)7個(gè)化合物進(jìn)行了除草活性測(cè)試，旨在發(fā)現(xiàn)具有除草活性的真菌源天然產(chǎn)物。

1 儀器與器材

1.1 菌種

菌株分離于湖北咸寧土壤(2015年12月采樣)，通過形態(tài)鑒定和18S rDNA比對(duì)分析鑒定為粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum)，現(xiàn)菌種保存于湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心(編號(hào)為NBERC_49006)。

1.2 儀器與試劑

Bruker AVANCE(500 MHz；600MHz)核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，δ為ppm，J為Hz)(德國(guó)Bruker BioSpin公司)；Waters 2695液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；Waters 2767高效液相制備儀(Waters 2525泵，帶2767自動(dòng)收集系統(tǒng)，2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器，色譜工作站Masslynx V4.0)；色譜柱：Sunfire C18OBD制備柱(5 μm,19×250 mm/10×250 mm，愛爾蘭)、Welch Ultmate XB-Phenyl 制備柱(3 μm,10×250 mm，中國(guó))、Innoval ODS-2制備柱(5 μm,10×250 mm，中國(guó))；柱色譜Sephadex LH-20凝膠(GE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞士)。提取分離用試劑乙酸乙酯和乙腈均為國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)；發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖 6.25 g/L，麥芽提取物 6.25 g/L，酵母提取物 1 g/L，蛋白胨 0.625 g/L，磷酸二氫鉀 1.25 g/L，硫酸鎂 0.625 g/L。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 真菌發(fā)酵

將粉紅單端孢菌斜面菌種接種于平皿中(PDA培養(yǎng)基)培養(yǎng)7天，再接入100瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(200 mL/500 mL錐形瓶)，在28 ℃、120 rpm振搖培養(yǎng)7天得發(fā)酵液。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離

大量發(fā)酵20 L的發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯攪拌提取3次，提取液過濾后真空濃縮得到提取物3.5 g。

將提取物用少量甲醇溶解，經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，用甲醇洗脫，洗脫組分通過HPLC檢測(cè)合并為4段(A～D)。B(0.6 g)經(jīng)制備色譜柱(Sunfire C18OBD制備柱，5 μm,19×250 mm，24 mL/min)進(jìn)行分離，洗脫梯度為5～100%乙腈，洗脫40 min，得到10個(gè)組分(A1～A10)，A3經(jīng)重結(jié)晶得到化合物1(32.6 mg),A4經(jīng)制備HPLC (Innoval ODS-2制備柱，5 μm,10×250 mm，7.5 mL/min)進(jìn)一步純化得到化合物3(5.9 mg)和7(2.9 mg)，A6經(jīng)重結(jié)晶得到化合物6(3.2 mg)，A7和A8經(jīng)制備HPLC (Welch Ultmate XB-Phenyl制備柱，3 μm,10×250 mm，7.5 mL/min)進(jìn)一步純化分別得到化合物2(2.9 mg)和4(4.5 mg)，A9經(jīng)制備HPLC(Sunfire C18OBD制備柱，5 μm,10×250 mm，7.5 mL/min)得到化合物5(23.0 mg)。

2.3 分離成分除草活性測(cè)定

選取擬南芥和狗牙根(Cynodondactylon)為雜草，擬南芥種子由本課題組微生物資源研究室提供，狗牙根種子為市售，已脫殼。擬南芥、脫殼狗芽根種子經(jīng)除菌處理后以無(wú)菌水反復(fù)振蕩、浸洗5 次以上，移除積水，種子攤開置于無(wú)菌操作臺(tái)中吹干，備用。把經(jīng)過高壓滅菌后的水瓊脂加入96 孔組織培養(yǎng)板(深孔)，冷卻后備用。把擬南芥、狗芽根種子分別轉(zhuǎn)接到瓊脂表面，接入種子量以單層種子全部覆蓋水瓊脂表面為準(zhǔn)。樣品以含0.1%TWeen-80的無(wú)菌水溶解，測(cè)試擬南芥時(shí)樣品濃度為10 μg/mL，測(cè)試狗牙根時(shí)樣品濃度為32 μg/mL，空白對(duì)照為0.1%TWeen-80的無(wú)菌水，重復(fù)2次[7,8]。培養(yǎng)條件為：溫度20 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強(qiáng)度8000 lx。從第5天開始檢查并記錄活性，根據(jù)除草活性反應(yīng)的不同，使用分級(jí)指標(biāo)數(shù)(0、3、5、7、9) 標(biāo)記除草活性，0表示沒有除草活性，株高與空白對(duì)照一致，3、5、7表示株高分別為空白對(duì)照的70%、50%以及30%，除草活性依次增強(qiáng)，9表示除草活性最強(qiáng)，種子沒有發(fā)芽。

將樣品及陽(yáng)性對(duì)照硝磺草酮配制成濃度為1.00 mg/mL的母液，以含0.1%TW-80的無(wú)菌水對(duì)半稀釋成12個(gè)不同濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)3次，按上述同樣方法進(jìn)行培養(yǎng)，7天后檢查并記錄結(jié)果，計(jì)算LC50。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末(CH3OH)；ESI-MS：m/z333[M+H]+;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:6.55 (1H,J=5.8,1.5 Hz,H-10),6.42 (1H,dd,J=11.5,7.3 Hz,H-19),5.80 (1H,dd,J=11.5,1.9 Hz,H-18),5.64 (1H,dd,J=7.9,3.7,H-4),4.08 (1H,d,J=5.8 Hz,H-11),3.87 (1H,d,J=5.2 Hz,H-2),3.11 (1H,d,J=4.0 Hz,H-13a),2.91 (1H,d,J=4.2 Hz,H-13b),2.87 (1H,d,J=1.5 Hz,H-7a),2.64 (1H,dd,J=15.6,7.9 Hz,H-3a),2.27 (1H,dd,J=15.4,1.5 Hz,H-7b),2.13 (3H,dd,J=7.3,1.8 Hz,CH3-20),2.04 (1H,ddd,J=15.6,5.3,3.7 Hz,H-3b),1.78 (3H,s,CH3-16),1.06 (1H,d,J=1.0 Hz,CH3-15),0.71 (3H,s,CH3-14);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:200.8 (s,C-8),167.5 (s,C-17),147.2 (d,C-19),139.5 (d,C-10),138.7 (s,C-9),121.2 (d,C-18),80.9 (d,C-2),75.0 (d,C-4),71.3 (d,C-11),66.7 (s,C-12),49.5 (s,C-5),48.2 (t,C-13),44.8 (s,C-6),43.1 (t,C-7),37.7 (t,C-3),18.7 (q,C-15),15.3 (q,C-16),15.7 (q,C-20),6.1 (q,C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為trichothecin。

化合物2白色粉末(CH3OH)；ESI-MS：m/z319[M+H]+;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:6.40 (1H,dd,J=11.5,7.3 Hz,H-19),5.81 (1H,dd,J= 11.5,1.8 Hz,H-18),5.63 (1H,dd,J=7.9,3.6 Hz,H-4),5.40 (1H,dd,J=5.8,1.5 Hz,H-10),3.86 (1H,d,J=5.2 Hz,H-2),3.64 (1H,d,J=5.8 Hz,H-11),3.12 (1H,d,J=4.0 Hz,H-13a),2.84 (1H,d,J=4.2 Hz,H-13b),2.58 (1H,dd,J=15.6,7.8 Hz,H-3a),2.17 (3H,dd,J=7.3,1.8 Hz,CH3-20),1.89～2.05 (4H,m,H-3b,H-7a,H-8a,H-8b),1.73 (3H,s,CH3-16),1.42 (1H,m,H-7b),0.98 (3H,s,CH3-15),0.72 (3H,s,CH3-14)；13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:167.4 (s,C-17),146.9 (d,C-19),141.3 (s,C-9),121.3 (d,C-18),119.4 (d,C-10),80.7 (d,C-2),75.2 (d,C-4),74.8 (d,C-11),66.7 (s,C-12),49.8 (s,C-5),48.2(t,C-13),41.6 (s,C-6),37.7 (t,C-3),28.8 (t,C-8),24.9 (t,C-7),18.7 (q,C-15),23.6 (q,C-16),16.2 (q,C-20),6.1 (q,C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為8-deoxy-trichotecin。

化合物3白色粉末(CH3OH);ESI-MS：m/z319[M+H]+;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:5.65 (1H,dt,J=17.2,9.8 Hz,H-15),5.12 (1H,dd,J=9.8,2.2 Hz,H-16a),4.95 (1H,dd,J=17.2,2.2 Hz,H-16b),4.63 (1H,brs,H-17a),4.52 (1H,br.s,H-17b),4.09 (1H,tt,J=11.5,4.3,H-2),2.41 (1H,overlapped,H-12a),2.37 (1H,overlapped,H-3a),2.24 (1H,t,J=9.8 Hz,H-14),2.09 (1H,ddd,J=12.0,4.3,1.9 Hz,H-1a),2.02 (1H,overlapped,H-12b),1.98 (1H,overlapped,H-7a),1.89 (1H,overlapped,H-11a),1.87 (1H,overlapped,H-6a),1.69 (1H,dq,J= 13.4,3.6 Hz,H-6b),1.24 (3H,s,CH3-19),1.13 (1H,overlapped,H-8),1.11 (1H,overlapped,H-5),1.09 (1H,overlapped,H-11b),1.00 (1H,overlapped,H-9),0.97 (1H,overlapped,H-3b),0.89 (1H,overlapped,H-1b),0.86 (1H,overlapped,H-7b),0.76 (3H,s,CH3-20)；13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:181.2 (s,C-18),152.5 (s,C-13),141.3 (d,C-15),116.9 (t,C-16),106.8 (t,C-17),65.4 (d,C-2),56.7 (d,C-5),56.1 (d,C-14),55.9 (d,C-9),49.4 (t,C-1),47.7 (t,C-3),46.0 (t,C-4),42.9 (d,C-8),40.1 (s,C-10),37.1 (t,C-12),35.4 (t,C-7),29.5 (q,C-19),28.2 (t,C-11),24.3 (t,C-6),14.4 (q,C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為engleromycenolic acid A。

化合物4白色粉末(CH3OH)；ESI-MS：m/z317[M-H]-;1H NMR (CD3OD,600 MHz)δ:5.83 (1H,dd,J=15.0,9.3 Hz,H-15),4.93 (1H,dd,J=15.0,0.8 Hz,H-16a),4.84 (1H,dd,J=9.3,0.8 Hz,H-16b),3.91 (1H,m,H-2),2.38 (1H,dd,J=13.8,3.2 Hz,H-1a),2.19 (1H,overlapped,H-3a),2.18 (1H,overlapped,H-6a),1.93 (1H,dd,J=14.6,4.9 Hz,H-6b),1.82 (1H,m,H-1b),1.65 (1H,m,H-11a),1.60 (1H,m,H-8),1.59 (1H,overlapped,H-12a),1.47 (1H,overlapped,H-7a),1.45 (1H,overlapped,H-14a),1.39 (1H,overlapped,H-3b),1.36 (1H,overlapped,H-11b),1.31 (1H,overlapped,H-7b),1.30 1H,(1H,overlapped,H-12b),1.27 (3H,s,CH3-19),1.10 (1H,dt,J=11.5,2.1 Hz,H-14b),1.04 (3H,s,CH3-17),0.94 (3H,s,CH3-20)；13C NMR (CD3OD,150 MHz)δ:181.0 (s,C-18),152.4 (d,C-15),138.8 (s,C-10),129.7 (s,C-5),109.4 (t,C-16),66.4 (d,C-2),50.0 (s,C-4),46.0 (t,C-3),40.6 (t,C-14),39.1 (d,C-8),38.9 (s,C-9),37.3 (s,C-13),35.6 (t,C-1),33.7 (t,C-12),32.8 (t,C-11),28.3 (t,C-6),26.7 (t,C-7),25.5 (q,C-19),23.7 (q,C-17),16.9 (q,C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為engleromycenolic acid B。

化合物5白色粉末(CH3OH)；ESI-MS：m/z319[M+H]+;1H NMR (CD3OD,600 MHz)δ:5.82 (1H,dd,J=15,9.3 Hz,H-15),4.93 (1H,dd,J=15 Hz,H-16a),4.85 (1H,dd,J=9.3 Hz,H-16b),4.09 (1H,dd,J=7.3,3.2 Hz,H-6),2.10 (1H,dd,J=11.7,5.1 Hz,H-7a),1.88 (1H,d,J=3.2 Hz,H-5),1.86 (1H,dd,J=11.7,4.8 Hz,H-7b),1.26 (3H,s,CH3-20),1.23 (3H,s,CH3-17),1.02 (3H,s,CH3-18)；13C NMR (CD3OD,150 MHz)δ:184.6 (s,C-19),152.5 (d,C-15),109.6 (t,C-16),90.4 (s,C-10),63.8 (d,C-6),56.6 (d,C-5),47.3 (s,C-4),41.5 (t,C-14),39.2 (s,C-9),37.4 (s,C-13),37.3 (t,C-3),33.7 (t,C-12),33.2 (d,C-8),33.2 (t,C-1),32.0 (t,C-11),23.0 (q,CH3-17),21.3 (t,C-2),17.2 (q,CH3-18),14.2 (q,CH3-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為rosololactone。

化合物6白色粉末(CH3OH)；ESI-MS：m/z317[M+H]+;1H NMR ((CD3)2CO,600 MHz)δ:5.88(1H,dd,J=15,9.2 Hz,H-15),4.99 (1H,dd,J=15,1.0 Hz,H-16a),4.89 (1H,dd,J=9.2,1.0 Hz,H-16b),2.68 (1H,dd,J=10.3,3.7 Hz,H-8),2.59 (1H,dd,J=12.1,4.4 Hz,H-5),2.36 (1H,dd,J=16.0,4.4 Hz,H-6a),2.12 (1H,dd,J=16.0,12.1 Hz,H-6b),1.07 (3H,s,CH3-18),1.01 (3H,s,CH3-17),0.90 (3H,s,CH3-20)；13C NMR ((CD3)2CO,150 MHz)δ:210.6 (s,C-7),179.9 (s,C-19),151.7 (d,C-15),110.4 (t,C-16),88.0 (s,C-10),51.4 (d,C-5),48.3 (s,C-8),48.0 (s,C-4),40.0 (s,C-9),36.8 (t,C-6),36.6 (t,C-3),36.4 (s,C-13),33.4 (t,C-14),32.8 (t,C-12),32.0 (t,C-11),31.2 (t,C-1),22.5 (q,CH3-17),21.3 (t,C-2),17.8 (q,CH3-18),17.6 (q,CH3-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為rosenonolactone。

化合物7白色粉末(CH3OH)；ESI-MS：m/z317[M-H]-;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:6.83 (1H,dd,J=17.3,10.9 Hz,H-14),5.32 (1H,t,J=6.6 Hz,H-12),5.19 (1H,d,J=10.9 Hz,H-15a),5.09 (1H,d,J=10.9 Hz,H-15b),4.89 (1H,s,H-17a),4.51 (1H,s,H-17b),4.14 (1H,m,H-2),2.48 (1H,dd,J=15.6,6.2,H-11a),2.41 (1H,overlapped,H-1a),2.38 (1H,overlapped,H-7a),2.24 (1H,m,H-11b),2.16 (1H,m,H-3a),1.99 (1H,overlapped,H-6a),1.97 (1H,overlapped,H-7b),1.84 (1H,m,H-6b),1.80 (1H,m,H-9),1.76 (3H,s,CH3-16),1.35 (1H,dd,J=12.2,2.8 Hz,H-5),1.27 (3H,s,CH3-18),1.07 (1H,m,H-3b),1.03 (1H,m,H-1b),0.70 (3H,s,CH3-20);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:181.1 (s,C-19),149.0 (s,C-8),135.0 (d,C-14),133.0 (s,C-13),132.3 (d,C-12),113.7 (t,C-15),108.7 (t,C-17),65.6 (d,C-2),58.2 (d,C-9),56.8 (d,C-5),49.2 (t,C-3),47.7 (t,C-1),46.2 (s,C-4),42.4 (s,C-10),39.5 (t,C-7),29.6 (q,CH3-18),26.9 (t,C-6),23.5 (t,C-11),20.0 (q,CH3-16),14.3 (q,CH3-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故確定該化合物為2α-hydroxy-cis-communic acid。

圖1 化合物1～7的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-7

3.2 除草活性

除草活性測(cè)試結(jié)果表明化合物1對(duì)擬南芥具有較強(qiáng)的除草活性，化合物2對(duì)擬南芥具有中等除草活性(表1)，LC50值分別為9.30 和28.98 μg/mL(表2)。

表1 化合物1～7的除草活性測(cè)試結(jié)果

注：化合物對(duì)擬南芥和狗牙根的測(cè)試濃度分別為10 μg/mL和32 μg/mL。

Note：For herbicidal tests,Arabidopsisthalianaat 10 μg/mL andCynodondactylonat 32 μg/mL.

表2 化合物1和2對(duì)擬南芥的除草活性

注：硝磺草酮為陽(yáng)性對(duì)照。

Note:Mesotrione as positive control.

4 結(jié)論

粉紅單端孢菌是一種內(nèi)生真菌，其主要次生代謝產(chǎn)物包括單端孢霉烯類(trichotecenes)和強(qiáng)心環(huán)肽類(cyclodepsipeptides)化合物。其中單端孢霉烯是一類含有三元環(huán)氧結(jié)構(gòu)的三環(huán)倍半萜，主要生物活性是抗腫瘤、抗菌[12,15,16]；而強(qiáng)心環(huán)肽是一類環(huán)縮肽類化合物，具有免疫抑制作用[17,18]。

本課題組發(fā)現(xiàn)粉紅單端孢菌的乙酸乙酯提取物具有除草活性，并從提取物中分離純化得到7個(gè)化合物，除了單端孢霉烯類化合物1和2以外，還有5個(gè)二萜類化合物3～7，其中化合物3為閉木花烷(cleistanthane)型二萜，化合物4～6為玫瑰烷(rosane)型二萜，且3和4首次從粉紅單端孢菌中得到，化合物7則為半日花烷(labdane)型二萜，首次從微生物中得到。除草活性測(cè)試表明化合物1和2對(duì)擬南芥有較好的除草活性，說(shuō)明粉紅單端孢菌中的除草活性物質(zhì)為單端孢霉烯類化合物，而該類化合物除草作用未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此，可對(duì)其進(jìn)行除草方面的進(jìn)一步研究，為真菌源除草先導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)提供良好的研究基礎(chǔ)。