楊曉蓓，顏 莎，胡江苗,周 俊*

1中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

石斛屬(Dendrobium)是蘭科(Orchidaceae)植物中第二大屬，我國(guó)石斛屬植物共有74種2變種，主要分布于秦嶺、淮河以南，云南、兩廣、海南等地區(qū)[1]。石斛藥材最早記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，具有滋陰清熱，生津益胃，潤(rùn)肺止咳，明目等功效。目前研究顯示石斛中主要包括多糖、生物堿、黃酮、酚類、萜類等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，石斛具有增強(qiáng)免疫、緩解糖尿病及其并發(fā)癥、抗腫瘤、抗氧化和延緩衰老、護(hù)肝、抗炎和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等功效[2,3]。

尖刀唇石斛(DendrobiumheterocarpumLindl.)生于海拔1 500～1 750米的山地疏林中樹干上，分布于云南南部至西部(勐臘、潞西、騰沖、鎮(zhèn)康)、斯里蘭卡、印度、尼泊爾、錫金、不丹、緬甸、泰國(guó)、老撾、越南、菲律賓、馬來(lái)西亞、印度尼西亞[1]。尖刀唇石斛莖呈細(xì)圓柱形，不分枝，常彎曲，表面金黃色或棕黃色，具細(xì)密的淺縱皺紋。質(zhì)輕而脆，斷面黃白色、平坦而疏松，味苦[4]。此花有栽培，具有較高的園藝價(jià)值。目前對(duì)尖刀唇石斛的研究主要集中于其離體快繁技術(shù)、觀賞特性和鑒定評(píng)價(jià)等，對(duì)其化學(xué)成分及藥理活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為了發(fā)掘尖刀唇石斛的藥用價(jià)值及為石斛資源合理的開(kāi)發(fā)利用提供一定的依據(jù)，本課題組對(duì)其乙酸乙酯提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，并從中分離得到15個(gè)化合物，分別鑒定為3,4′-二羥基-5-甲氧基聯(lián)芐(1)、batatasin Ⅲ(2)、3-羥基-4′,5-二甲氧基聯(lián)芐(3)、3-O-methylgigantol(4)、gigantol(5)、3,4-二羥基-4′,5-二甲氧基聯(lián)芐(6)、moscatilin(7)、dendrocandin A(8)、(S)-3,4,α-三羥基-4′,5-二甲氧基聯(lián)芐(9)、densiflorol A(10)、dendrocandin I(11)、dendrocandin F(12)、coelonin(13)、紅花素(14)、4-羥基-2-甲氧基-3,6-二甲基苯甲酸(15)。以上化合物均為首次從該植物中分離得到，其中化合物14為首次從該屬植物中分離得到，并篩選出部分化合物對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的一氧化氮生成抑制活性和自由基清除活性進(jìn)行研究，為尖刀唇石斛深入的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

Avance Ⅲ-400超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó)布魯克拜厄斯賓有限公司)、Avance Ⅲ-500超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó)布魯克拜厄斯賓有限公司)、Avance Ⅲ-600 型超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó)布魯克拜厄斯賓有限公司),API QSTAR Pulsari 液相四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MDS Scipaszex,Concord,Ontario,Canada),Auto Spec Premier P776 三扇型雙聚焦質(zhì)譜儀(Waters,USA),Agilent 1100半制備液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)海道夫),FlexStation 多功能酶標(biāo)儀(Bio-RAD 680，美國(guó))，薄層層析硅膠、柱層析硅膠(青島美高集團(tuán)有限公司，中國(guó))，Sephadex LH-20 ( Ameisham Biosciences,Uppsala,Sweden),MCI gel CHP-20P (Mitsubishi Chemical Corp.,Tokyo,Japan);用于半制備的試劑為色譜純，其余均為分析純。脂多糖、NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)、DPPH、ABTS(sigma公司)，一氧化氮檢測(cè)試劑盒(廣州碧云天)。小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

尖刀唇石斛采自云南文山，經(jīng)文山學(xué)院丁長(zhǎng)春副教授鑒定為蘭科石斛屬植物尖刀唇石斛(DendrobiumheterocarpumLindl.)，標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取分離

尖刀唇石斛全草鮮品13 kg干燥粉碎后用40 L丙酮浸泡三次，合并提取液減壓濃縮得到丙酮部位浸膏320 g，先后用乙酸乙酯、正丁醇分別合并萃取，減壓回收萃取液乙酸乙酯和正丁醇，最終得到乙酸乙酯部位浸膏95 g，正丁醇部位浸膏77 g。

其中乙酸乙酯部位，經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-丙酮，100∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、0∶1)系統(tǒng)梯度洗脫，得到6個(gè)組分(Fr.1～Fr.6)。Fr.1(6.7g)經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯，100∶0、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、0∶1)系統(tǒng)梯度洗脫得到5個(gè)組分(Fr.1.1～Fr1.5)，F(xiàn)r.1.1經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析(三氯甲烷-甲醇，1∶1)純化得到化合物15(3 mg)。

Fr.2(2.0 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析(三氯甲烷-甲醇，1∶1)分離得到1個(gè)組份(Fr.2.1)和化合物3(128 mg)和10(2 mg)。

Fr.3(4.5 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析(三氯甲烷-甲醇，1∶1)分離得到3個(gè)組份(Fr.3.1～Fr.3.3)。Fr.3.1經(jīng)正相硅膠柱(石油醚-丙酮，3∶1)得到2個(gè)組份(Fr.3.1.1～Fr.3.1.2)，F(xiàn)r.3.1.2依次通過(guò)凝膠柱層析(三氯甲烷-甲醇，1∶1)、半制備HPLC(甲醇-水，70%)分離得到化合物12(10 mg)；Fr.3.1.1經(jīng)過(guò)MCI柱(甲醇-水，20%～100%)、正相硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯 3∶2)、Sephadex LH-20凝膠柱層析(三氯甲烷-甲醇，1∶1)分離得到化合物11(5 mg)、8(8 mg)和6(7 mg)。Fr.3.2經(jīng)過(guò)正相硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯 5∶1)、Sephadex LH-20凝膠柱層析(三氯甲烷-甲醇，1∶1)、半制備HPLC分離得到化合物4(3 mg)和9(3 mg)。

Fr.4(5.4 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析(三氯甲烷-甲醇，1∶1)分離得到5個(gè)組份(Fr.4.1～Fr.4.5)。Fr.4.5經(jīng)過(guò)正相硅膠柱(三氯甲烷-甲醇，40∶1)、Sephadex LH-20凝膠柱層析(三氯甲烷-甲醇，1∶1)、半制備HPLC(甲醇-水，45%)分離得到化合物5(11 mg)，半制備HPLC(甲醇-水，70%)分離得到化合物1(37 mg)和2(22 mg)；Fr.3.5經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱層析(甲醇-水，90%)、半制備HPLC(甲醇-水，60%)分離得到化合物7(7 mg)。

Fr.5(4.3 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析(三氯甲烷-甲醇，1∶1)分離得到5個(gè)組份(Fr.5.1～Fr.5.5)。Fr.5.5經(jīng)過(guò)正相硅膠柱(石油醚-丙酮，10∶1)、半制備HPLC(甲醇-水，65%)分離得到化合物13(5 mg)和14(6 mg)。

2.2 RAW264.7細(xì)胞NO生成抑制活性

以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為體外炎癥反應(yīng)模型，一氧化氮合酶抑制劑NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA，IC50=34 μmol/L)為陽(yáng)性對(duì)照(50 μmol/L)，Griess試劑顯色法檢測(cè)NO的生成量，同時(shí)以MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力，考察石斛中酚類化合物的抗炎作用。

將RAW264.7細(xì)胞接種至96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，棄去上清液，用1mg/mL的LPS誘導(dǎo)，同時(shí)加入終濃度為25 μmol/L的化合物溶液，設(shè)置LPS對(duì)照組和L-NMMA陽(yáng)性對(duì)照組，培養(yǎng)過(guò)夜，分別取各組50 μL上清液隨后加入Griess試劑I和試劑II各50 μL，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，30 min內(nèi)于540 nm處測(cè)定吸光度值，利用公式1計(jì)算NO生成抑制率。同時(shí)用MTS檢測(cè)細(xì)胞活力，排除化合物的細(xì)胞毒性對(duì)NO生成的影響。

NO生成抑制器(%)=(LPS對(duì)照組OD540nm-樣品組OD540nm)/LPS對(duì)照組OD540nm×100%

(1)

2.3 自由基清除實(shí)驗(yàn)

DPPH是1,1-二苯基-2-三硝基苯肼[1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl ]的英文簡(jiǎn)稱，ABTS是2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)]的英文簡(jiǎn)稱，其測(cè)定自由基清除作用是基于電子轉(zhuǎn)移的方法，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定顏色的變化來(lái)反映抗氧化能力的強(qiáng)弱。

2.3.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

精密稱取DPPH試劑4.0 mg，用無(wú)水乙醇定容至10 mL，待用。5倍稀釋DPPH自由基溶液，在96孔板中加入25 μmol/L的化合物100 μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，再加入稀釋的DPPH自由基溶液100 μL，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和化合物空白對(duì)照，以同濃度的水溶性維生素E(Trolox)為陽(yáng)性對(duì)照，常溫反應(yīng)37 ℃避光靜置反應(yīng)30 min后于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定OD值，記為DS，空白對(duì)照記為DC，化合物對(duì)照記為DSC，按公式2計(jì)算自由基清除率(SR)。

SR(%)=[1-(DS-DSC)]/DC×100% (2)

2.3.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

精密稱取ABTS試劑40.0 mg，用蒸餾水定容至10 mL，再精密稱取過(guò)硫酸鉀7.0 mg，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻后與ABTS水溶液混合，室溫黑暗處反應(yīng)12～16 h，產(chǎn)生ABTS自由基，避光保存，待用。15倍稀釋ABTS自由基溶液，在96孔板中加入25 μmol/L的化合物100 μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，再加入稀釋的ABTS自由基溶液100 μL，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和化合物對(duì)照，以同濃度的水溶性維生素E(Trolox)為陽(yáng)性對(duì)照，常溫反應(yīng)5 min后于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定OD值，記為DS，空白對(duì)照記為DC，化合物對(duì)照記為DSC，按公式2計(jì)算自由基清除率(SR)。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds

化合物1白色粉末(三氯甲烷);(+)-ESIMS：m/z267 [M+Na]+;C15H16O3;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δH:6.96 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),6.66 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),6.20 (1H,d,J=1.9 Hz,H-2),6.19 (1H,d,J=1.9 Hz,H-6),6.16 (1H,brs,H-4),2.74 (4H,m,H-α,α′),3.69 (3H,s,OCH3-3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δC:162.2 (s,C-3),159.3 (s,C-5),156.4 (s,C-4′),145.6 (s,C-1),134.0 (s,C-1′),130.4 (d,C-2′,6′),116.0 (d,C-3′,5′),109.1 (d,C-6),106.6 (d,C-2),99.9 (d,C-4),39.7 (t,C-α),38.1 (t,C-α′),55.5 (q,OCH3-3)； 。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為3,4′-二羥基-5-甲氧基聯(lián)芐。

化合物2紅色油狀物(三氯甲烷);(+)-ESIMS：m/z267 [M+Na]+;C15H16O3;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δH:7.13(1H,t,J=7.6 Hz,H-5′),6.75(1H,dd,J=7.6,1.9 Hz,H-6′),6.65(1H,dd,J=7.6,1.9 Hz,H-4′),6.64(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),6.32(1H,d,J=2.0 Hz,H-4),6.25(2H,brs,H-2,6),2.81(4H,m,H-α,α′),3.74(3H,s,OCH3-3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δC:160.8(s,C-3),156.6(s,C-5),155.5(s,C-3′),144.4(s,C-1),143.6(s,C-1′),129.6(d,C-5′,6′),121.0(d,C-6′),115.4(d,C-2′),112.9(d,C-4′),108.0(d,C-6),106.8(d,C-2),99.1(d,C-4),37.7(t,C-α),37.3(t,C-α′),55.3(q,OCH3-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為batatasinⅢ。

化合物3黃色油狀物(三氯甲烷);C16H18O3;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH:7.09(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′,6′),6.83(2H,d,J=8.6 Hz,H-3′,5′),6.32(1H,t,J=1.8 Hz,H-6),6.26(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.25(1H,d,J=1.8 Hz,H-4),2.82(4H,m,H-α,α′),3.79(3H,s,OCH3-4′),3.75(3H,s,OCH3-5);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δC:160.8(s,C-4′),157.8(s,C-5),156.6(s,C-3),144.6(s,C-1),133.8(s,C-1′),129.4(d,C-2′,6′),113.8(d,C-3′,5′),108.0(d,C-2),106.8(d,C-6),99.0(d,C-4),38.2(t,C-α),36.7(t,C-α′),55.3(q,OCH3-3′),55.2(q,OCH3-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為3-羥基-4′,5-二甲氧基聯(lián)芐。

化合物4白色無(wú)定形粉末(三氯甲烷);C17H20O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH:6.79(1H,d,J=8.1 Hz,H-5′),6.72(1H,dd,J=8.1,1.9 Hz,H-6′),6.66(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),6.32(1H,t,J=1.9 Hz,H-4),6.25(2H,d,J=1.9 Hz,H-2,6),2.82(4H,m,H-α,α′),3.86(3H,s,OCH3-3′),3.84(3H,s,OCH3-4′),3.75(3H,s,OCH3-3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δC:159.8(s,C-3),155.6(s,C-5),147.7(s,C-3′),146.2(s,C-1),143.5(s,C-4′),133.3(s,C-1′),119.2(d,C-6′),110.8(d,C-5′),110.2(d,C-2′),106.9(d,C-6),105.8(d,C-2),97.9(d,C-4),37.2(t,C-α),36.1(t,C-α′),54.9(q,OCH3-3),54.8(q,OCH3-3′),54.2(q,OCH3-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為3-O-methylgigantol。

化合物5白色無(wú)定形粉末(三氯甲烷);(+)-ESIMS：m/z297 [M+ Na]+;C16H18O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH:6.84(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.68(1H,dd,J=8.0,1.9 Hz,H-6′),6.63(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),6.32(1H,t,J=1.9 Hz,H-4),6.25(2H,d,J=1.9 Hz,H-2,6),2.81(4H,m,H-α,α′),3.84(3H,s,OCH3-3′),3.75(3H,s,OCH3-3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δC:160.8(s,C-3),156.6(s,C-5),146.3(s,C-3′),144.6(s,C-1),143.7(s,C-4′),133.7(s,C-1′),121.0(d,C-6′),114.2(d,C-5′),111.2(d,C-2′),108.1(d,C-6),106.8(d,C-2),99.0(d,C-4),38.3(t,C-α),37.3(t,C-α′),55.9(q,OCH3-3′),55.3(q,OCH3-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為gigantol。

化合物6淡黃色油狀物(三氯甲烷);C16H18O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH:7.09(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′,6′),6.82(2H,d,J=8.6 Hz,H-3′,5′),6.45(1H,d,J=1.8 Hz,H-6),6.24(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),2.79(4H,m,H-α,α′),3.82(3H,s,OCH3-5),3.79(3H,s,OCH3-4′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δC:157.8(s,C-4′),146.8(s,C-5),133.9(s,C-3),133.8(s,C-4),130.5(s,C-1),130.4(s,C-1′),129.4(d,C-2′,6′),113.7(d,C-3′,5′),108.7(d,C-6),103.6(d,C-2),38.1(s,C-α),37.2(t,C-α′),56.1(q,OCH3-5),55.3(q,OCH3-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為3,4-二羥基-4′,5-二甲氧基聯(lián)芐。

化合物7黃色油狀物(三氯甲烷);(+)-ESIMS：m/z327 [M+ Na]+;C17H20O5;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH:6.83(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.68(1H,dd,J=8.0,1.9 Hz,H-6′),6.61(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),6.36(2H,s,H-2,6),2.81(4H,m,H-α,α′),3.85(6H,s,OCH3-3,5),3.84(3H,s,OCH3-3′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δC:146.8(s,C-3,5),146.2(s,C-3′),143.7(s,C-4′),133.7(s,C-1′),132.9(s,C-4),132.8(s,C-1),121.1(d,C-6′),114.2(d,C-5′),111.2(d,C-2′),105.2(d,C-2,6),38.5(t,C-α′),38.0(t,C-α),56.3(q,OCH3-3,5),55.9(q,OCH3-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為moscatilin。

化合物10白色無(wú)定形粉末(三氯甲烷);(+)-ESIMS：m/z295 [M+ Na]+;C16H16O4;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH:6.72(1H,d,J=7.8 Hz,H-5′),6.68(1H,d,J=1.7 Hz,H-2′),6.62(1H,dd,J=7.8,1.7 Hz,H-6′),6.31(1H,s,H-4),6.25(2H,s,H-2,6),5.92(2H,s,H-7′),3.76(3H,s,OCH3-3),2.79(4H,m,H-α,α′);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δC:159.7(s,C-12′),156.6(s,C-5),147.5(s,C-3′),145.7(s,C-4′),144.4(s,C-1),135.5(s,C-1′),121.2(d,C-6′),108.9(d,C-2′),108.1(d,C-5′),107.9(d,C-6),106.8(d,C-2),100.8(t,C-7′),99.0(d,C-4),55.3(q,OCH3-3),38.2(t,C-α),37.3(t,C-α′)。以上數(shù)據(jù)[14]與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為densiflorol A。

化合物13淡黃色油狀物(甲醇);(+)-ESIMS：m/z265 [M+ Na]+;C15H16O3;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δH:7.98(1H,d,J=8.2 Hz,H-5),6.61(1H,d,J=8.2,2.7 Hz,H-6),6.59(1H,d,J=2.7 Hz,H-8),6.38(1H,d,J=2.3 Hz,H-1),6.29(1H,d,J=2.3 Hz,H-3),2.62(4H,s,H-9,10),3.81(3H,s,OCH3-4);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δC:159.1(s,C-4),157.5(s,C-2),156.1(s,C-7),141.8(s,C-8a),140.5(s,C-1a),130.0(d,C-5),126.2(s,C-5a),116.8(s,C-4a),115.0(d,C-6),113.6(d,C-8),108.3(d,C-1),99.2(d,C-3),31.8(t,C-9),31.2(t,C-10),55.8(q,OCH3-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物13為coelonin。

化合物14黃色粉末(甲醇);(+)-ESIMS：m/z289 [M+ H]+;C15H12O6;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δH:7.30(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′,6′),6.81(2H,d,J=8.6 Hz,H-3′,5′),5.87(1H,s,C-8),5.31(1H,dd,J=13.0,3.0 Hz,H-2),3.09(1H,dd,J=17.2,13.0 Hz,H-3a),2.67(1H,dd,J=17.2,3.0 Hz,H-3b);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δC:197.6(s,C-4),168.8(s,C-4′),165.5(s,C-9),164.9(s,C-5),159.0(s,C-7),131.1(s,C-1′),129.0(d,C-2′,6′),116.3(d,C-3′,5′),103.3(d,C-10),96.3(d,C-8),80.4(d,C-2),44.0(t,C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物14為紅花素。

化合物15無(wú)色針晶(甲醇);1H NMR(500 MHz,CDCl3)δH:12.02(1H,s,-COOH),6.20(1H,s,H-5),3.91(3H,s,OCH3-2),2.45(3H,s,CH3-6),2.09(3H,s,CH3-3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δC:172.6(s,-COOH),163.2(s,C-4),158.0(s,C-2),140.2(s,C-6),110.5(d,C-6),108.5(s,C-5),105.3(s,C-1),51.8(q,OCH3-2),24.1(q,CH3-6),7.7(q,CH3-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物15為4-羥基-2-甲氧基-3,6-二甲基苯甲酸。

3.2 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞NO生成抑制活性

對(duì)尖刀唇石斛中分離得到的7個(gè)化合物(2、3、4、5、10、11、14)在25 μmol/L濃度下對(duì)RAW264.7細(xì)胞的NO生成抑制作用進(jìn)行篩選，其結(jié)果如表1所示：

化合物Compound抑制率Inhibitionrate(%)L-NMMA?57.91±1.50246.06±0.26351.15±0.27446.01±0.30551.57±0.361013.72±1.921158.54±0.161431.72±0.51

注：L-NMMA(50 μmol/L)，一氧化氮合酶抑制劑，IC50=34 μmol/L。

Note:L-NMMA(50 μmol/L), an NO synthase inhibitor,was used as a positive control (IC50=34 μmol/L).

3.3 自由基清除實(shí)驗(yàn)

從尖刀唇石斛乙酸乙酯提取物中分離得到的化合物大多屬于酚類化合物，多羥基的結(jié)構(gòu)使其具有自由基清除能力。實(shí)驗(yàn)使用ABTS法和DPPH法對(duì)分離得到的6個(gè)化合物(1、2、5、6、9、12)在25 μmol/L濃度下自由基清除能力進(jìn)行了檢測(cè)，以水溶性維生素E(Trolox)為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

化合物CompoundABTS自由基清除率ABTS+radicalscavengingrate(%)DPPH自由基清除率DPPHradicalscavengingrate(%)Trolox?50.71±7.5856.86±0.50131.13±3.190.68±1.45234.88±4.111.93±1.24540.97±6.555.36±1.09628.32±2.9433.13±2.20916.58±2.7521.79±1.011229.89±5.3821.08±1.19

注：Trolox (25 μmol/L)，水溶性維生素E，自由基清除陽(yáng)性對(duì)照。

Note:Positive control used for radical scavenging assay at the concentration of 25 μmol/L.

4 結(jié)論

本文對(duì)尖刀唇石斛的乙酸乙酯提取物進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，從中分離鑒定了15個(gè)化合物，均為首次從尖刀唇石斛中分離得到。對(duì)其中7個(gè)化合物的一氧化氮生成抑制活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)化合物3、5、11在25 μmol/L濃度下，對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的NO生成抑制率均在50%以上，其中化合物11與50 μmol/L的陽(yáng)性對(duì)照藥L-NMMA抑制效果相當(dāng)。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，炎癥與許多疾病息息相關(guān)。石斛作為傳統(tǒng)中藥材，具有滋陰清熱的功效?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，石斛中的菲類及聯(lián)芐類化合物都表現(xiàn)出一定的抗炎活性[20,21]。在25 μmol/L濃度下化合物1、2、5和12均表現(xiàn)出一定的ABTS自由基清除能力，其中化合物5的結(jié)果最為顯著，其半數(shù)清除濃度(IC50)為36.41± 1.99 μmol/L；而6、9、12三個(gè)化合物顯示出DPPH自由基清除能力，其中效果最顯著的為化合物6，其IC50為62.05± 3.40 μmol/L，化合物5和6具有較好的體外抗氧化能力。尖刀唇石斛多用于觀賞，藥用方向少有報(bào)道，本文首次揭示了尖刀唇石斛中體外抗炎和抗氧化的活性成分，為尖刀唇石斛的深入開(kāi)發(fā)利用提供一定理論基礎(chǔ)。