唐小涵，陳艷妮，湯紅玉，李博婷，汪云松，曾 英，郝小江，邸迎彤*

1云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650091；2中國科學(xué)院昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201

牛筋果Harrisoniaperforata(Blanco) Merr.是苦木科牛筋果屬植物，該屬植物全球共四種，產(chǎn)熱帶非洲、熱帶亞洲和大洋洲。我國只產(chǎn)一種，多產(chǎn)福建,廣東和海南等地；常見于低海拔的灌木林和疏林中[1]。牛筋果根、莖、葉均可入藥，具有清熱、解毒、截瘧等功效，在民間常用于治療瘧疾、瘡癰、外感風(fēng)熱、咳嗽、咯痰及咽喉腫痛等[2,3]。目前，國內(nèi)外學(xué)者在對牛筋果化學(xué)成分的研究中發(fā)現(xiàn)，其根、莖、葉富含色原酮、聚酮、香豆素類、檸檬苦素類以及苦木素類化合物[4,5]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其粗提物表現(xiàn)出很好的抗瘧活性和選擇性[6]、昆蟲拒食活性和殺蚊活性[7,8]以及一定的抗菌活性[9]。該屬植物的化學(xué)成分研究主要集中在具有環(huán)系復(fù)雜多變、重排現(xiàn)象普遍特點(diǎn)的檸檬苦素成分[10,11]以及苦木科的特征性次生代謝產(chǎn)物苦木素上。本課題組在前期的研究中分離鑒定了具有優(yōu)異殺蟲活性的新穎結(jié)構(gòu)C-25型苦木素perforalactone A[12]以及具有新穎骨架類型的檸檬苦素類化合物perforanoid A[13]。為了尋找植物牛筋果中的活性化學(xué)成分，作者對牛筋果小枝的乙酸乙酯部位進(jìn)行了研究，從中分離鑒定了14個(gè)酚性化合物，其中化合物1、3、5～10、和12～13共10個(gè)化合物為首次從牛筋果中分離得到。本研究進(jìn)一步豐富了牛筋果的化學(xué)成分多樣性，為牛筋果資源的深入開發(fā)利用提供了一定的依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

1H和13C NMR譜由DRX-500和Avance Ⅲ-600型超導(dǎo)核磁共振儀(Bruker,德國)測定；ESI由島津UPLC-IT-TOF液相-離子阱飛行時(shí)間色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Shimadzu,日本)測定；HPLC分離用安捷倫1260液相色譜儀(Agilent,美國)開展，色譜柱為沃特世XSelect CSH C18(5 μm,10×250 nm)；凝膠Sephadex LH-20(40～70 μm)購自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司；反向填充材料Lichroprep RP-18 gel(40～63 μm)購自德國默克公司；柱層析用硅膠(100～200目，200～300目，300～400目)，薄層層析硅膠板(GF254)購自青島海洋化工廠；甲醇，乙酸乙酯，丙酮，二氯甲烷，石油醚等有機(jī)溶劑均為工業(yè)純經(jīng)重蒸后使用；液相甲醇和液相乙腈購自新藍(lán)景公司；顯色劑為10%的硫酸-乙醇溶液。

TECAN Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(TECAN，瑞士)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水溶性維生素E(Trolox)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(分析純)購自西隴科學(xué)股份有限公司。

牛筋果Harrisoniaperforata(Blanco) Merr.的枝葉于2018年1月采自海南；植物樣品由海南熱帶生物技術(shù)研究所黃圣卓副研究員采集并鑒定。標(biāo)本(NO.20180104)存放于昆明植物研究所植物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

牛筋果植物樣品采自牛筋果莖100 kg。粉碎后經(jīng)甲醇回流提取三次，合并提取液減壓回收溶劑。將濃縮后的提取物加水懸浮，分別用石油醚和乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取物(1000 g)MCI小孔樹脂進(jìn)行脫色，采用甲醇-水(30%～100%)梯度洗脫后經(jīng)TLC檢測合并分為5個(gè)部分(Fr1～5)。Fr3部分經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫)分為5個(gè)流分(Fr.3.1～Fr.3.5)。Fr.3.2部分利用重結(jié)晶方法分離得到化合物1(76 mg)和2(25 mg)。Fr.3.3經(jīng)RP-18反相色譜層析，水-甲醇(30%～100%)梯度洗脫，TLC檢驗(yàn)合并相同流分得到6個(gè)流分(Fr.3.3.1～Fr.3.3.6)。Fr.3.3.1經(jīng)半制備 HPLC(Waters X-Select CSH C-18，5 μm，10 × 250 nm，3 mL/min，acetonitrile：H2O=25%)得到化合物7(4.1 mg)。Fr.3.3.2部分經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20柱(甲醇)凝膠層析及正相硅膠柱色譜層析后，經(jīng)半制備 HPLC(Waters X-Select CSH C-18,5 μm,10×250 nm，3 mL/min,acetonitrile：H2O=28%)得到化合物8(11 mg)、9(2.2 mg)和10(2.1 mg)。Fr.3.3.4部分經(jīng)Sephadex LH-20柱(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)凝膠層析后得到化合物4(26.5 mg)。Fr.3.3.5部分經(jīng)Sephadex LH-20柱(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)凝膠層析和正相硅膠板色譜層析后得到化合物5(13.7 mg)和6(34.6 mg)。Fr4部分經(jīng)正相硅膠柱層析，二氯甲烷：甲醇(120∶1～0∶1梯度洗脫)分為3個(gè)流分(Fr.4.1～Fr.4.3)。Fr.4.2經(jīng)RP-18反相色譜層析，水-甲醇(30%～100%)梯度洗脫，TLC檢驗(yàn)合并相同流分得到5個(gè)流分(Fr.4.2.1～Fr.4.2.5)。Fr.4.2.2部分經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20柱(甲醇)凝膠層析及硅膠柱色譜層析后，經(jīng)半制備 HPLC(Waters X-Select CSH C-18，5 μm，10 × 250 nm，3 mL/min，acetonitrile：H2O=30%)純化得到化合物3(2 mg)、11(25.4 mg)、12(1.5 mg)。Fr.4.2.3部分經(jīng)反復(fù)凝膠及硅膠柱色譜層析后得到化合物13(12.8 mg)和14(16.1 mg)。

2.2 DPPH自由基清除活性

本實(shí)驗(yàn)參考Brand-williams等[14,15]報(bào)道的方法并加以改進(jìn)。精密配置2 mM濃度的DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)溶液作為儲(chǔ)備液待用。將樣品溶解于DMSO溶液，配置成10 mg/mL作為樣品母液。實(shí)驗(yàn)過程中，將DPPH儲(chǔ)備液稀釋10倍至0.2 μM，得到DPPH工作液；將樣品母液逐級稀釋配制成濃度梯度的樣品溶液，以Trolox作為陽性對照；配制反應(yīng)體系：取樣品溶液100 μL及DPPH溶液100 μL，室溫下震搖混勻，在96孔板中室溫避光反應(yīng)30 min后，用酶標(biāo)儀測量各孔在517 nm處的吸光值，平行測定三次。DPPH自由基清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%，其中A0為以相同體積甲醇代替樣品溶液的陰性對照組吸光值，A1為加樣組的吸光值，A2為甲醇代替DPPH工作液的空白組吸光值。初篩濃度為500 μM，對初篩清除率大于50%的化合物進(jìn)行復(fù)篩，使用GraphPad Prism7軟件計(jì)算半數(shù)有效濃度(EC50)。

圖1 化合物1～14的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-14

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末；ESI-MS:m/z191 [M-H]-，分子式C10H8O4；1H NMR (500 MHz,MeOD)δ:6.29 (1H,d,J=2.1,H-2),6.18 (1H,d,J=2.1,H-5),6.01 (1H,s,H-7),2.32 (3H,s,H-CH3);13C NMR (125 MHz,MeOD)δ: 183.9 (C-1),169.1 (C-6),166.0 (C-3),163.3 (C-8),159.9 (C-4),109.0 (C-2),105.1 (C-9),100.1 (C-8),95.0 (C-5),20.3 (CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定為去甲丁香色原酮(noreugenin)。

化合物2白色粉末；ESI-MS:m/z221([M-H]-)，分子式C11H10O5；1H NMR (500 MHz,(CD3)2CO)δ:6.48 (1H,d,J=2.3 Hz,H-2),6.31 (2H,m,H-5,H-7),4.53 (2H,d,J=4.8 Hz,H-3-CH2OH),3.89 (3H,s,H-6-OCH3);13C NMR (125 MHz,(CD3)2CO)δ:184.3 (C-1),171.5 (C-3),166.6 (C-6),163.1 (C-8),158.8 (C-4),106.6 (C-2),98.6 (C-7),93.0 (C-5),61.1 (C-3-CH2OH),56.4 (C-6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故鑒定為柴胡色原酮A(Saikochromone A)。

化合物3黃色油狀；ESI-MS:m/z243 ([M+Na]+)，分子式C12H12O4；1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:6.42 (1H,d,J=2.3 Hz,H-5),6.33 (1H,d,J=2.3 Hz,H-2),6.01 (1H,s,H-7),3.93 (s,3H,H-8-OCH3),3.87 (s,3H,H-6-OCH3),2.27 (s,3H,H-3-CH3);13C NMR (150 MHz,CDCl3)δ:177.5 (C-1),163.7 (C-2),163.0 (C-6),160.9 (C-4),160.2 (C-8),112.0 (C-2 and C-9),95.9 (C-7),92.6 (C-5),56.4 (C-8-OCH3),55.7 (C-6-OCH3),19.8 (C-3-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致，故鑒定為5,7-dimethoxy-2-methylchromone。

化合物4白色粉末；ESI-MS:m/z311 ([M+Na]+)，分子式C16H16O5；1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ:1.43 (6H,s,gem-Me),3.87(3H,s,H-OMe),4.49 (2H,s,H-CH2OH),5.52 (1H,d,J=10 Hz H-3′),6.21 (1H.s.H-3),6.26 (1H.s.H-6),6.61 (1H.d,J=10 Hz,H-4′);13C NMR (125 MHz,CDCl3)δ:178.3 (C-4),165.6 (C-2),160.4 (C-8a),157.9 (C-8),153.9 (C-4a),127.3 (C-3′),115.0 (C-4′),109.6 (C-3),108.5 (C-8),102.4 (C-4a),96.5 (C-6),78.1 (C-2′),60.9 (C-CH2OH),56.3 (C-OCH3),28.2 (C-gem-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，故鑒定為2-hydroxymethylalloptaeroxylin。

化合物5白色粉末；ESI-MS:m/z165 ([M-H]-)，分子式C9H10O3；1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ:7.93 (1H,d,J=8.3 Hz,H-2,6),6.86 (1H,d,J=8.3 Hz,H-3,5),4.33 (2H,q,J=7.1 Hz,H-1′),1.37 (3H,t,J=7.1 Hz,H-2′);13C NMR (125 MHz,CDCl3)δ:166.8 (C-7),160.5 (C-4),155.1 (C-5),131.8 (C-2),130.0 (C-6),122.4 (C-1),115.2 (C-3),60.8 (C-1′),14.3 (C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道一致，故鑒定為羥苯乙酯(ethylparaben)。

化合物6黃色粉末；ESI-MS:m/z249 ([M+Na]+)，分子式C11H14O5；1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ:7.34 (2H,s,H-2,H-6),5.93 (1H,brs,H-OH),4.35 (2H,q,J=7.0 Hz,H-OCH2CH3),3.92 (6H,s,2×OCH3),1.38 (3H,t,J=7.1 Hz,OCH2CH3);13C NMR (125 MHz,CDCl3)δ:166.4 (C-7),146.6 (C-3,C-5),139.2 (C-4),121.4 (C-1),106.6 (C-2,C-6),70.0 (C-1′),56.4 (2×OCH3),14.4 (C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致，故鑒定為苯丙酮(propiophenone)。

化合物7白色粉末；ESI-MS:m/z355 ([M+Na]+)，分子式C18H20O6；1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ:6.89 (1H,s,H-2),6.89 (1H,s,H-5),6.89 (1H,s,H-6),6.78 (1H,s,H-6′),6.53 (1H,s,H-3′),5.49 (1H,d,J=6.7 Hz,H-7),3.90 (2H,m,H-9),3.87 (3H,s,3-OCH3),3.86 (3H,s,2′-OCH3),3.84 (3H,s,1′-OCH3),3.54 (1H,dd,J=11.7,5.8 Hz,H-8),13C NMR (125 MHz,CDCl3)δ:154.3 (C-4′),150.3 (C-2′),146.7 (C-3),145.7 (C-4),133.5 (C-1),119.1 (C-2),116.1 (C-5′),114.4 (C-5),108.4 (C-6),108.4 (C-6′),95.1 (C-3′),87.5 (C-7),64.4 (C-9),57.0 (C-1′),57.0 (C-1′-OCH3),56.1 (C-3′-OCH3),56.0 (C-3-OCH3),53.7 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致，故鑒定為cephafortin B。

化合物8淡黃色粉末；ESI-MS:m/z383 ([M+Na]+)，分子式C20H24O6；1H NMR (600 MHz,MeOD)δ:6.94 (1H,d,J=1.6 Hz,H-2),6.81 (1H,dd,J=8.2,1.7 Hz,H-6),6.75 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.72 (2H,s,H-4′,H-6′),5.48 (1H,d,J=6.3 Hz,H-7),,3.82 (3H,s,3-OCH3),3.86 (3H,s,3′-OCH3),3.80 (1H,m,H-9b),3.75 ( 1H,dd,J=11.0,7.2 Hz,H-9a),3.56 (1H,t,J=6.5 Hz,H-9′),3.46 (1H,dd,J=12.3,6.3 Hz,H-8),2.62 (2H,m,H-7′),1.81 (1H,m,H-8′);13C NMR (150 MHz,MeOD)δ:149.1 (C-3),147.5 (C-4),147.5 (C-2′),145.2 (C-3′),136.9 (C-5′),134.8 (C-1),129.9 (C-1′),119.7 (C-6),117.9 (C-6′),116.1 (C-5),114.0 (C-4′),110.5 (C-2),89.0 (C-7),65.0 (C-9),62.2 (C-9′),56.7 (C-3′-OCH3),56.3 (C-3-OCH3),55.4 (C-8),35.8 (C-8′),32.9 (C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道一致，故鑒定為去氫雙松柏醇(dehydroconiferyl alcohol)。

化合物9黃色油狀；ESI-MS:m/z535 ([M+Na]+)，分子式C28H32O9；1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:6.92 (1H,d,J=1.4 Hz,H-2),6.80 (1H,dd,J=8.2,1.5 Hz,H-6),6.75 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.66 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5"),6.59 (1H,s,H-6′),6.58 (1H,d,J=1.3 Hz,H-2"),6.56 (1H,dd,J=8.1,1.5 Hz,H-6"),6.48 (1H,s,H-2′),5.51 (1H,d,J=5.8 Hz,H-7),4.52 (1H,d,J=5.2 Hz,H-7′),3.89 (1H,dd,J=10.7,7.1 Hz,H-9′),3.72 (1H,m,H-9)，3.80 (3H,s,3-OH3),3.71 (3H,s,3′-OCH3),3.69 (3H,s,3"-OH3),3.68 (1H,m,H-9′),3.64 (1H,m,H-9),3.44 (1H,dd,J=12.6,5.5 Hz,H-8),3.18 (3H,s,7′-OH3),2.84 (1H,dd,J=12.2,6.8 Hz,H-8′);13C NMR (150 MHz,CDCl3)δ:149.2 (C-3),148.6 (C-4′),148.3 (C-3"),147.8 (C-4),146.3 (C-4"),145.1 (C-3′),135.4 (C-1),134.5 (C-1′),132.0 (C-1"),129.3 (C-5′),123.2 (C-6"),119.7 (C-6),117.2 (C-6′),116.2 (C-5),115.6 (C-5"),114.7 (C-2"),112.7 (C-2′),110.5 (C-2),89.3 (C-7),85.0 (C-7′),65.3 (C-9),64.3 (C-9′),57.2 (7′-OCH3),56.7 (3-OCH3),56.5 (C-8′),56.3 (3′-OCH3),56.3 (3"-OCH3),55.3 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致，故鑒定為hawthornnin C。

化合物10黃色油狀；ESI-MS:m/z535 ([M+Na]+)，分子式C28H32O9；1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:6.90 (1H,d,J=1.6 Hz,H-2),6.78 (1H,dd,J=8.2,1.6 Hz,H-6),6.72 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.67 (1H,s,H-6′),6.66 (1H,d,J=7.7 Hz,H-5"),6.58 (1H,d,J=1.5 Hz,H-2"),6.57 (1H,dd,J=8.1,1.7 Hz,H-6"),6.47 (1H,s,H-2′),5.49 (1H,d,J=6.3 Hz,H-7),4.51 (1H,d,J=5.4 Hz,H-7′),3.89 (1H,dd,J=10.7,6.9 Hz,H-9′),3.80 (1H,dd,J=10.9,5.7 Hz,H-9),3.79 (3H,s,H-3-OCH3),3.72 (3H,s,H-3′-OH3),3.68 (3H,s,H-3"-OCH3),3.73 (1H,dd,J=11.1,7.3 Hz,H-9′),3.66 (1H,dd,J=10.8,6.8 Hz,H-9),3.45 (1H,dd,J=12.3,6.3 Hz,H-8),3.18 (3H,s,7′-OH3),2.87 (1H,dd,J=12.5,6.6 Hz,H-8′);13C NMR (150 MHz,CDCl3)δ:149.7 (C-3),149.3 (C-4′),148.7 (C-3"),148.5 (C-4),146.7 (C-4"),145.1 (C-3′),135.2 (C-1),133.4 (C-1′),131.8 (C-1"),129.6 (C-5′),123.2 (C-6"),119.9 (C-6),117.2 (C-6′),116.6 (C-5),115.7 (C-5"),114.7 (C-2"),112.7 (C-2′),110.5 (C-2),89.4 (C-7),85.0 (C-7′),65.0 (C-9),64.3 (C-9′),57.2 (C-7′-OCH3),56.5 (C-3-OCH3),56.4 (C-8′),56.4 (C-3-OCH3),56.3 (C-3′-OCH3),55.2 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致，故鑒定為hawthornnin D。

化合物11白色粉末；ESI-MS:m/z441 ([M+Na]+)，分子式C22H26O8；1H NMR (600 MHz,MeOD)δ:6.65 (4H,s,H-2′,2",6′,6"),4.71 (2H,d,J=4.0 Hz,H-2,6),4.26 (2H,dd,J=8.9,6.8 Hz,H-4,8),3.87 (2H,dd,J=9.1,3.3 Hz,H-4,8),3.84 (12H,s,4×OCH3),3.14 (2H,d,J=1.5 Hz,H-l,5);13C NMR (150 MHz,MeOD)δ:149.4 (C-3′,3",5′,5"),136.5 (C-4′,4"),132.9 (C-1′,1"),104.5 (C-2′,2",6′,6"),87.7 (C-2,6),72.6 (C-4,8),56.8 (C-3′,3",5′,5"-OCH3),55.5 (C-1,5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道一致，故鑒定為丁香樹脂酚(syringaresinol)。

化合物12白色粉末；ESI-MS:m/z387 ([M-H]-)，分子式C21H24O7；1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:6.90 (1 H,d,J=2.7 Hz,H-3),6.89 (1 H,d,J=2.5 Hz,H-6"),6.82 (1 H,dd,J=8.1,2.1 Hz,H-2"),6.58 (2H,s,H-2′,6),5.64 (1 H,s,H-4′ or 4"OH),5.53 (1 H,s,H-4′ or 4"OH),4.73 (1H,d,J=4.7 Hz,H-2),4.71 (1H,d,J=4.7 Hz,H-6),4.27 (2H,m,H-4a,8a),3.90 (9H,s,C-3′,5′,5"-OCH 3),3.4 (2H,m,H-4b,8b),3.10 (2H,m,H-l,5);13C NMR (150 MHz,CDCl3)δ:147.1 (C-5′and C-3′),146.7 (C-5"),145.2 (C-1"),134.2 (C-1′),132.8 (C-4"),132.1 (C-4′),118.9 (C-2"),114.3 (C-3"),108.6 (C-6"),102.7 (C-2′ and C-6′),86.1 (C-2),85.8 (C-6),71.8 (C-8),71.6 (C-4),56.3 (C-5′-OCH3and C-3′-OCH3),55.9 (C-5" -OCH3),54.4 (C-5),54.1 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道一致，故鑒定為皮樹脂醇(medioresinol)。

化合物13白色粉末；ESI-MS:m/z395 ([M+Na]+)，分子式C20H20O7；1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ:6.93 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2"),6.91 (1H,d,J=1.6 Hz,H- 6′),6.89 (1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6"),6.88 (1H,dd,J=8.4,1.6 Hz,H-2′),6.80 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5"),6.78 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5),5.33 (dt,J=7.4,3.6 Hz,2H,H-3 and H-7),4.33 (1H,dd,J=6.9,1.3 Hz,Hb-1),4.04 (1H,dd,J=9.4,4.6 Hz,Ha-1),3.90 (3H,s,OCH3),3.90 (1H,m,H-8),3.91 (3H,s,OCH3),3.46 (1H,dd,J=8.8,3.4,H-4);13C NMR (125 MHz,CDCl3)δ:177.1(C-5),147.0(C-3′),146.8 (C-3"),145.6 (C-4′),145.3 (C-4"),132.4 (C-1′),132.3 (C-1"),118.4 (C-6′),118.1 (C-6"),114.7 (C-5′),114.4 (C-5"),108.2 (C-2"),108.1 (C-2′),84.7 (C-7),83.4 (C-3),72.7 (C-1),56.1 (OCH3),56.0 (OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道一致，故鑒定為4-ketopinoresinol。

化合物14白色粉末；ESI-MS:m/z381 ([M+Na]+)，分子式C20H22O6；1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ:6.70 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.68 (1H,d,J=7.9 Hz,H-5),6.63 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.56 (1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6′),6.50 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.48 (1H,dd,J=7.9,2.0 Hz,H-6),4.13 (1H,dd,J=9.1,7.0 Hz,H-9′),3.89 (1H,dd,J=9.1,7.4 Hz,H-9),3.77 (3H,s,OCH3),3.76 (3H,s,OCH3),2.87 (1H,dd,J=14.0,5.4 Hz,H-7a),2.80 (1H,dd,J=14.0,7.0 Hz,H-7b),2.62～2.43 (4H,m,H-7,H-8,H-8′);13C NMR (125 MHz,CDCl3)δ:181.6 (C-9),149.0 (C-3 and C-3′),146.3 (C-4),146.2 (C-4′),131.3 (C-1),130.7 (C-1′),123.1 (C-6),122.3 (C-6′),116.3 (C-5),116.2 (C-5′),113.8 (C-2),113.2 (C-2′),73.0 (C-9′),56.5 (C-3-OCH3),56.4 (C-3′-OCH3),47.8 (C-8),42.5 (C-8′),39.0 (C-7),35.4 (C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]報(bào)道一致，故鑒定為羅漢松脂酚(matairesinol)。

3.2 對DPPH自由基的清除活性

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的含氮自由基，結(jié)構(gòu)中存在單電子。當(dāng)化合物具有酚羥基時(shí)，可以提供氧原子，與自由基結(jié)構(gòu)中的孤對單電子配對，從而減少電子數(shù)目，起到清除自由基的作用。使用清除DPPH自由基的方法，對牛筋果中酚性化合物1～14進(jìn)行了體外抗氧化活性篩選，從表1可以看出化合物7～14在500 μM的初篩濃度下，對DPPH自由基的清除率達(dá)到了50%以上，說明其具有一定的抗氧化能力。進(jìn)一步測定這幾個(gè)化合物在不同濃度下的DPPH自由基清除率，牛筋果酚性物質(zhì)對DPPH自由基的清除作用如圖2所示，由圖可以看出，化合物7～14在1～500 μM對DPPH自由基均有清除作用，且隨濃度升高，清除作用增強(qiáng)。其中，化合物11和12清除自由基能力與陽性對照Trolox (64.42±4.65 μM)相當(dāng)；而化合物13和14EC50分別為53.88±5.34和32.67±3.96 μM，優(yōu)于陽性對照。對比化合物1～6，化合物7～14活性更好，應(yīng)當(dāng)是由于鄰對位酚羥基及其個(gè)數(shù)增強(qiáng)了其自由基清除能力；此外，化合物13～14活性優(yōu)于11～12，對比結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)前兩者包含有γ-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)單元，而后兩者是呋喃結(jié)構(gòu)單元，這可能是由于γ-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)單元結(jié)構(gòu)單元顯著提高了其生物利用度。

序號No.化合物Compound清除率Scavengerate(%)EC50(μM)1去甲丁香色原酮Noreugenin6.652-2柴胡色原酮ASaikochromoneA9.208-35,7-Dimethoxy-2-methylchromone1.631-42-Hydroxymethylalloptaeroxylin20.68-5羥苯乙酯Ethylparaben5.864-6苯丙酮Propiophenone5.498-7CephafortinB60.22-8去氫雙松柏醇Dehydroconiferylalcohol53.93-9HawthornninC76.10125.4±26.510HawthornninD67.73133.6±31.111丁香樹脂酚Syringaresinol93.3768.4±5.6512皮樹脂醇Medioresinol92.0477.73±4.87134-Ketopinoresinol87.5553.88±5.3414羅漢松脂酚Matairesinol88.6832.67±3.96水溶性維生素ETrolox-64.42±4.65

圖2 不同濃度樣品對DPPH清除能力的影響Fig.2 Effects of different concentration samples on DPPH radical scavenging antioxidant activity

4 結(jié)論

本研究從采自我國海南的牛筋果中分離鑒定了14個(gè)化合物，其中10個(gè)化合物為首次從牛筋果中分離得到。此外，化合物13和14表現(xiàn)出顯著的DPPH自由基清除能力，并開展了其抗氧化構(gòu)效關(guān)系初步的研究，初步分析認(rèn)為鄰對位酚羥基及其個(gè)數(shù)與γ-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)單元是是牛筋果中酚性化合物對DPPH自由基清除能力的主要活性位點(diǎn)。本文首次揭示了牛筋果中抗氧化的活性成分，為合理開發(fā)牛筋果的藥用資源和新型抗氧化劑提供了科學(xué)依據(jù)。