石 亞，劉 文*，王永林，鞏仔鵬，王 群，李勇軍，金 陽，姚曉艷

1貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025；2貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，隨著病情不斷的進(jìn)展，直至發(fā)展為腎臟衰竭，嚴(yán)重威脅人們的健康[1]，腎病的常規(guī)治療主要為給予血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素受體阻滯劑藥物。然而，常規(guī)治療未顯示對(duì)腎足細(xì)胞的預(yù)防，也未顯示抑制腎小管細(xì)胞凋亡和腎纖維化的優(yōu)點(diǎn)。因此，越來越多的研究人員考慮中醫(yī)療法，以彌補(bǔ)腎病常規(guī)治療的不足。長期以來，中藥已應(yīng)用于臨床上各種不同疾病的治療，黃芪已被中醫(yī)廣泛使用數(shù)千年，國內(nèi)外研究表明，黃芪具有保護(hù)腎臟、治療慢性腎臟疾病的作用[2-4]，黃芪甲苷(AS-Ⅳ)是其主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、降血糖、抑制纖維化等作用[5-8]，已有文獻(xiàn)報(bào)道AS-Ⅳ對(duì)慢性腎臟疾病具有保護(hù)和治療作用[9-12]，在腎病的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，AS-Ⅳ在正常大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布已有研究，但其在2型糖尿病腎病(db/db)小鼠體內(nèi)組織分布尚未有相關(guān)報(bào)道，而糖尿病腎病狀態(tài)下，動(dòng)物發(fā)生了許多生理及病理上的變化，藥物在各組織中的分布行為也可能發(fā)生變化[13]。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ在正常及2型糖尿病腎病(db/db)小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC、T1/2、MRT、CLZ/F、VZ/F具有顯著性差異，且AS-Ⅳ在2型糖尿病腎病(db/db)小鼠體內(nèi)的生物利用度高于其在正常小鼠體內(nèi)，為進(jìn)一步考察AS-Ⅳ在正常與病理生物體體內(nèi)在不同組織內(nèi)的分布差異，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)所得AS-Ⅳ藥時(shí)曲線結(jié)果，選取尾靜脈注射給予AS-Ⅳ后15 min、2 h、4 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)AS-Ⅳ在正常與2型糖尿病腎病(db/db)小鼠體內(nèi)各組織分布情況進(jìn)行對(duì)比研究，探討2型糖尿病腎病病理狀態(tài)下，AS-Ⅳ在體內(nèi)的分布情況，為AS-Ⅳ在2型糖尿病腎病的臨床應(yīng)用及新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，AS-Ⅳ、地高辛分子結(jié)構(gòu)式見圖1。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AB Sciex QTRAP 5500型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國sciex公司)，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，EL204 型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，MTN-2800D型氮吹

圖1 AS-Ⅳ、地高辛分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of all the analytes注：AS-Ⅳ；B地高辛。Note:A.Astragaloside Ⅳ;B.Digoxin.

濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)，VX-III多管渦混振蕩器(廣州航信科學(xué)儀器有限公司)，IMS-20全自動(dòng)制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司)，Allegra 64R型低溫高速離心機(jī)(美國Beckman Coulter 公司)，組織勻漿器(墨西哥BioSpec Products公司)。

1.2 材料

黃芪甲苷(AS-IV，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)201717，純度≥97%)，地高辛 (Digoxin，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)201717，純度≥98%)，甲酸(美國DIKMA科技有限公司)、乙腈(美國TEDIA有限公司)、甲醇(美國TEDIA有限公司)，水為屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)采用db/db小鼠(動(dòng)物品種品系[T002407]BKS-Leprem2Cd479/Nju)，購買于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，SPF級(jí)，合格證號(hào)為201806848，許可證號(hào)為SCXK(蘇)2018-0008，雌雄各半。db/db小鼠由于瘦素受體點(diǎn)突變從而導(dǎo)致瘦素信號(hào)通路障礙，因此導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗、高血糖等癥狀，12 周齡時(shí)可出現(xiàn)糖尿病腎病等并發(fā)癥，實(shí)驗(yàn)直接購買12周齡db/db小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后， 開始實(shí)驗(yàn)。以db/m小鼠為正常對(duì)照組，均飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)之前12 h禁食不禁水。

2型糖尿病腎病db/db小鼠和db/m正常小鼠腎組織常規(guī)固定、脫水透明、石蠟包埋切片后，Masson 染色，光學(xué)顯微鏡下對(duì)腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取AS-Ⅳ和地高辛，加入甲醇，超聲使其完全溶解，配制成濃度為0.5 mg/mL的儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)前用50%的甲醇溶液稀釋到相應(yīng)的濃度，所有溶液于4 ℃條件下保存。

2.1.2 HPLC-MS/MS分析條件

ACE Excel 2 C18-AR(100 mm × 2.1 mm,2 μm,USA)色譜柱，流動(dòng)相乙腈(B)-0.1% 甲酸水溶液(A)梯度洗脫(0～0.6min，90% A；0.6～2 min，90% A→70% A；2～6 min，70% A→35% A；6～8 min，35% A→10% A；8～9 min，10% A→10% A；9～9.1 min，10% A→90% A；9.1～12 min，90% A)流速0.4 mL/min，柱溫 25 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

采用正離子模式掃描；氣簾氣35 psi；離子源溫度550 °C；壓力4 500 V，AS-Ⅳm/z:807.4/627.4;DP 168 V；CXP 16 V，地高辛m/z: 825.3/649.5；DP 80 V；EP 10 V；CE 53ev；CXP 53 V。

2.1.3 AS-IV注射樣品溶液的制備

精密稱取一定量AS-Ⅳ，加入生理鹽水，超聲使其完全溶解，配制濃度為2 mg/mL的AS-Ⅳ注射溶液。

2.1.4 給藥方案與樣品采集

動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)之前12 h禁食不禁水，模型db/db小鼠與正常db/m小鼠各18只，分別隨機(jī)分為3組，每組6只。全部小鼠以8 mg/kg劑量尾靜脈注射給藥后，分別于15 min、2 h、4 h處死小鼠，迅速取心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、腦、肌肉等組織，用生理鹽水沖洗凈后，于-80 ℃的條件下保存待處理。

2.1.5 組織樣本預(yù)處理

各組織解凍后，剪成小塊，加入5倍量的生理鹽水，3 000 rpm高速勻漿2 min，組織勻漿液于6 000 rpm離心10 min得上清液，精密移取上清液500 μL，精密加入0.502 mg/mL地高辛內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，120 μL的1%的甲酸溶液，渦混1 min，加入2 mL的甲醇溶液，渦混5 min，超聲5 min，在4 ℃的環(huán)境下以12 000 rpm離心10 min，分離上清液，37 ℃氮?dú)饬飨聯(lián)]干。殘留物用50%甲醇500 μL復(fù)溶，渦流5 min，超聲20 min，在4 ℃的環(huán)境下以12 000 rpm離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)分析。

2.1.6 方法學(xué)考察

以肺、心、腎為代表性組織，根據(jù)2018年FDA 生物分析方法學(xué)驗(yàn)證指南[14]對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證內(nèi)容包括專屬性、線性范圍、最低定量限、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性。

2.2 結(jié)果

2.2.1 2型糖尿病腎病db/db小鼠和db/m正常小鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)比較

與db/m正常小鼠比較，2型糖尿病腎病(db/db)小鼠的腎小球基底膜及腎小管間質(zhì)可見大量膠原纖維，并且明顯多于正常組，說明有膠原纖維沉積，腎纖維化明顯，如圖2所示。

圖2 2型糖尿病腎病db/db小鼠和db/m正常小鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察(Masson，× 400)Fig.2 Pathomorphological observation of kidney in db/db mice and db/m normal mice and type 2 diabetic nephropathy (Masson,× 400)注：A.2型糖尿病腎病db/db小鼠；B.db/m正常小鼠。Note:A.Type 2 diabetic nephropathy db/db mice;B.db/m normal mice.

2.2.2 專屬性考察

取 500 μL大鼠空白組織勻漿液(以肺為代表)，按“2.1.5組織樣品處理方法”項(xiàng)下方法操作(不加內(nèi)標(biāo))，獲得空白組織樣品 A色譜圖；將一定濃度對(duì)照品溶液和地高辛內(nèi)標(biāo)加溶液入空白組織勻漿液，依同法操作，獲得B色譜圖；取大鼠給藥后的組織勻漿液，依法操作得C色譜圖，結(jié)果見圖3，地高辛在4.59 min時(shí)出峰，AS-Ⅳ 5.04 min時(shí)出峰，各組織中沒有物質(zhì)干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，專屬性良好；地高辛、AS-Ⅳ的MRM離子質(zhì)譜圖如圖4所示。

2.2.3 定量下限和標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取100 μL系列不同濃度的AS-Ⅳ對(duì)照溶液，分別加入到空白小鼠肺、腎、脾、心、胃、小腸、肝、腦、肌肉組織勻漿中。按“2.1.5”項(xiàng)的方法前處理后檢測(cè)，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法作線性回歸運(yùn)算，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1，各成分在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，以線性范圍的最低濃度作為AS-Ⅳ的定量下限。

圖3 肺組織HPLC-MS/MS色譜圖Fig.3 HPLC-MS/MS chromatogram of lung tissue注：肺空白組織色譜圖(A)； 肺空白組織+內(nèi)標(biāo)(地高辛)+AS-Ⅳ色譜圖(B)； 注射給藥后15 min肺部組織色譜圖(C)；1.地高辛；2.AS-Ⅳ。Note:lung blank tissue chromatogram(A);lung blank tissue + internal standard (Digoxin) + Astragaloside Ⅳ chromatogram(B);Lung tissue chromatogram 15 min after injection(C);1.Digoxin;2.Astragaloside Ⅳ.

圖4 地高辛、AS-Ⅳ的MRM離子質(zhì)譜圖Fig.4 MRM ion mass spectrometry of Digoxin and AS- Ⅳ注:A.地高辛的MRM離子質(zhì)譜圖；B.AS-Ⅳ的MRM離子質(zhì)譜圖。Note:A.MRM ion mass spectrometry of Digoxin;B.MRM ion mass spectrometry of AS- Ⅳ.

表1 組織中AS-Ⅳ的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.2.4 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

對(duì)低、中、高(100、400、2 000 ng/mL)三個(gè)AS-Ⅳ濃度的小鼠肺、心、腎組織勻漿液的日內(nèi)精密度和日間精密度進(jìn)行了考察，結(jié)果表明AS-Ⅳ日內(nèi)精密度和日間精密度 RSD值均小15%，準(zhǔn)確度范圍相對(duì)誤差(RE)為-4.42%～11.83%，結(jié)果顯示該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，結(jié)果見表2。

2.2.5 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

取低、中、高(100、400、2 000 ng/mL)三個(gè)AS-Ⅳ濃度的小鼠肺、心、腎組織勻漿樣品各6份，分析峰面積得A。肺、心、腎組織勻漿樣品離心后獲得的上清液中加入低、中、高(100、400、2 000 ng/mL)三個(gè)濃度的AS-Ⅳ樣品分析峰面積得B。取低、中、高(100、400、2 000 ng/mL)三個(gè)濃度的AS-Ⅳ分析峰面積得C，提取回收率=A/B，基質(zhì)效應(yīng)=B/C，結(jié)果顯示，AS-Ⅳ提取回收率在87.95%～97.95%，基質(zhì)效應(yīng)在86.39%～97.70%，地高辛基質(zhì)效應(yīng)在93.29%～104.86%，結(jié)果表明，測(cè)定方法提取回收率良好，無基質(zhì)干擾，結(jié)果見表2。

表2 AS-Ⅳ的精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)及地高辛的基質(zhì)效應(yīng)

2.2.6 穩(wěn)定性的考察

取低、中、高(100、400、2 000 ng/mL)三個(gè)AS-Ⅳ濃度的肺、心、腎組織勻漿樣品?？疾鞓悠吩谑覝叵路胖?24 h，冷藏(-80 ℃)48 h 和凍融三次的穩(wěn)定性，結(jié)果表明樣品在各種情況下均穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

表3 AS-Ⅳ在肺、心、腎中的穩(wěn)定性

2.2.7 AS-Ⅳ的組織分布研究

以8 mg/kg劑量AS-Ⅳ尾靜脈注射給予正常小鼠(db/m)和2型糖尿病腎病模型(db/db)小鼠AS-Ⅳ，于15 min、2 h、4 h等不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，收集心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、腦、肌肉等組織，按“2.1.5項(xiàng)” 下組織樣本預(yù)處理方法處理，“2.1.2項(xiàng)” 下HPLC-MS/MS條件測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 AS-IV在小鼠體內(nèi)的分布情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01， BLQ：低于定量限 10 ng/mL。

Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01,BLQ:lower than the quantitative limit of 10 ng/mL.

單次尾靜脈注射8 mg/kg AS-Ⅳ后，AS-Ⅳ在正常小鼠體內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)各個(gè)器官中的分布情況為：15 min：肺>腎>胃>心>脾>小腸>肝>肌肉，2 h：肺>腎>心>脾>小腸>胃>肝>肌肉>腦，4 h：肺>腎>胃>心>脾>小腸>肝>肌肉>腦，AS-Ⅳ在二型糖尿病腎病模型db/db小鼠體內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)各個(gè)器官中的分布情況為：15 min：肺>腎>胃>心>脾>肝>小腸>肌肉，2 h：肺>腎>心>脾>胃>小腸>肝>肌肉>腦，4 h：肺>腎>胃>脾>心>肝>小腸>肌肉>腦。

同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ在正常及2型糖尿病腎病db/db小鼠體內(nèi)分布均較廣，但濃度偏低；且在大腦中能檢測(cè)出AS-Ⅳ，說明AS-Ⅳ靜脈注射給藥后，能通過血腦屏障。給藥15 min，2 h，4 h時(shí)，AS-Ⅳ在肺、腎、心、胃、脾等組織中濃度較高；其中在肺、腎組織中濃度最高，在小腸、肝、肌肉、腦等組織中濃度較低，且在正常及模型小鼠肺、腎、心、胃、脾等組織中的濃度約為在小腸、肝、肌肉、腦等組織中濃度的5～300倍，部分組織中的AS-Ⅳ濃度隨時(shí)間的延長而逐步降低。

從AS-Ⅳ在正常與病理狀態(tài)下各組織分布狀況及含量分析得知，機(jī)體處于2型糖尿病腎病狀態(tài)，可顯著影響AS-Ⅳ在體內(nèi)的分布。AS-Ⅳ對(duì)肺、腎組織分布具有一定靶向性。單次尾靜脈注射給藥后，病理狀態(tài)下，給藥15 min時(shí)，AS-Ⅳ在肺、腎、心、胃、脾、肝等組織中含量較正常狀態(tài)下高(P<0.05，P<0.01)，病理狀態(tài)下，各組織對(duì)AS-Ⅳ親和力較正常高；給藥2 h時(shí)，AS-Ⅳ在肺、腎、脾、心、胃、肝等組織中含量較正常狀態(tài)下高(P<0.05，P<0.01)，病理狀態(tài)下，AS-Ⅳ分布較正常狀態(tài)下廣；給藥4 h時(shí)，AS-Ⅳ在肝、脾、肺、腎組織中含量均較正常狀態(tài)下高(P<0.05，P<0.01)，AS-Ⅳ在病理狀態(tài)下的藥物消除能力降低；成分在體內(nèi)存留時(shí)間延長，結(jié)果說明病理狀態(tài)下有可能存在藥物蓄積趨勢(shì)。

3 討論

藥物進(jìn)入機(jī)體后會(huì)隨循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)送至各組織中，由于藥物的理化性質(zhì)以及體內(nèi)各組織的生理特征差異，藥物在生物體內(nèi)分布存在差異[15]，會(huì)直接影響到藥物的治療效果、蓄積、毒副反應(yīng)。因此，研究AS-Ⅳ在各組織中的分布特點(diǎn)，特別是腎病變病理組織中的分布特點(diǎn)，有利于AS-Ⅳ抗糖尿病腎病相關(guān)藥物制劑的研發(fā)和改進(jìn)，使藥物最大限度地作用于靶器官，提高臨床療效。

本研究表明AS-Ⅳ在正常與病理狀態(tài)下各組織分布狀況存在著一定的差異。糖尿病腎病病理狀態(tài)下，AS-Ⅳ在肝、脾、肺、腎濃度顯著高于在正常組織中，在正常及糖尿病腎病病理狀態(tài)下AS-Ⅳ在各組織中的分布有著較大的差異，可能是由于，病理狀態(tài)下各個(gè)臟器中轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和功能會(huì)發(fā)生改變，從而影響藥物在體內(nèi)的處置過程發(fā)生明顯改變[16]，同時(shí)，糖尿病腎病狀態(tài)下，鼠的腎功能遭到損傷，可能也是導(dǎo)致AS-Ⅳ在正常及病理狀態(tài)下體內(nèi)分布出現(xiàn)差異的原因之一。

尾靜脈注射給藥后，AS-Ⅳ在小鼠的各組織中分布較廣泛，主要分布在肺中，其次是腎，原因可能為：一方面黃芪為補(bǔ)氣藥，主歸肺經(jīng)，其次藥物進(jìn)入機(jī)體后會(huì)隨循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)送至各組織中，生理上，肺為臟腑之華蓋，百脈之所朝會(huì)，全身的血液都通過百脈流經(jīng)于肺，而腎臟是藥物排泄的主要排泄器官，原形藥物及其代謝產(chǎn)物通過腎由尿液排出；由于肺與腎生理特征的差異，一定程度上會(huì)影響到AS-Ⅳ在各器官內(nèi)的分布，這可能是導(dǎo)致AS-Ⅳ在肺中分布多于腎的原因。肺氣虛損可以導(dǎo)致腎氣衰弱；腎陰不足，精氣不能上滋于肺，而致肺腎兩虛，同時(shí)，黃芪具有補(bǔ)益肺氣的功效，已有文獻(xiàn)報(bào)道，AS-Ⅳ對(duì)肺損傷有保護(hù)作用，因此，AS-Ⅳ在肺中分布多于腎，對(duì)腎病的防治也有著積極的意義。同時(shí)，腦中有少量的AS-Ⅳ分布，說明AS-Ⅳ可通過血腦屏障，且病理狀態(tài)下，有助于AS-Ⅳ通過血腦屏障，本研究對(duì)AS-Ⅳ的臨床合理運(yùn)用及新藥的研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。