牛 忻，閆 娜，李篤信，馬文平，時(shí) 宇，劉江云*，周 勝

1蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院中藥系，蘇州 215123；2北方民族大學(xué)夏洛蒂醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合研究實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；3菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，菏澤 274000

枸杞是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用功能食品，中國(guó)藥典收載枸杞子為寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥成熟果實(shí)，功能滋補(bǔ)肝腎，益精明目，用于虛勞精虧，腰膝酸痛，眩暈耳鳴，陽(yáng)萎遺精，內(nèi)熱消渴，血虛萎黃，目昏不明[1]?，F(xiàn)代研究證實(shí)枸杞具有調(diào)節(jié)免疫，抗炎，保護(hù)細(xì)胞、血管、神經(jīng)，以及抗衰老和抗腫瘤等多種藥理作用[2,3]。枸杞多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖蛋白[2-4]，近年來對(duì)其免疫調(diào)節(jié)[5,6]、降血糖[7]，調(diào)節(jié)腸道菌群[8,9]等功效的研究報(bào)道較為集中。但由于枸杞多糖相對(duì)含量較低、物質(zhì)組成復(fù)雜[10,11]，傳統(tǒng)的分離純化方法較為低效；另一方面，其結(jié)構(gòu)表征方法和技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，缺乏專屬性的質(zhì)量分析方法，這些困難限制了對(duì)枸杞多糖功效與其作用機(jī)制的深入研究。

本文針對(duì)傳統(tǒng)分離效率低下的問題，采用中壓制備液相色譜純化系統(tǒng)(MPLC)對(duì)枸杞多糖的在線分離方法進(jìn)行研究。該色譜系統(tǒng)配備電導(dǎo)/pH/DAD檢測(cè)器和自動(dòng)輸液、流分收集系統(tǒng)，適于在線分析控制和優(yōu)化工藝參數(shù)。在分離方法上，主要選用DEAE弱陰離子交換色譜進(jìn)行分離，并對(duì)具體工藝參數(shù)如填料類型、流動(dòng)相種類、pH、離子強(qiáng)度和洗脫條件等進(jìn)行考察，建立優(yōu)化的枸杞多糖分離色譜條件。對(duì)分離純化的多糖組分，系統(tǒng)采用高效分子排阻色譜(HPSEC)、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)(HPAEC-PAD)、紫外-可見分光光度計(jì)等分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和質(zhì)量分析，為枸杞多糖的制備技術(shù)和專屬性質(zhì)量分析方法提供參考。在此基礎(chǔ)上，采用HPSEC法對(duì)枸杞多糖在人工模擬胃腸道環(huán)境的代謝過程進(jìn)行初步考察，為枸杞多糖的深入開發(fā)與應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞(批號(hào)：181101)產(chǎn)地中寧，經(jīng)北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院馬文平教授鑒定為寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)的果實(shí)。系列葡聚糖T-10、T40、T70、T110、T200均購(gòu)自北京拜爾迪生物公司； D-無水葡萄糖(批號(hào)110833-201205，標(biāo)示含量99.5%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；十八種氨基酸(套)標(biāo)準(zhǔn)品、L-羥脯氨酸，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；葡萄糖醛酸(批號(hào)D1216012)購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司；牛血清白蛋白(批號(hào)M00118010)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。DEAE 650M弱陰離子填料和TSK-GEL G4000和G3000 PWXL色譜柱(7.8×300 mm)購(gòu)自日本Tosoh公司；Sephadex G25填料購(gòu)自美國(guó)GE公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

APPS MV 10D中壓制備液相色譜儀(利穗科技有限公司)；LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；Microza MF/UF 小型實(shí)驗(yàn)?zāi)ぴO(shè)備和3K超濾膜(旭化成分離膜裝置有限公司)；Freezone 2.5 L凍干機(jī)(美國(guó)Labconco)；HPAEC-PAD 850離子色譜儀(瑞士萬通中國(guó)有限公司)；ME215S電子天平(德國(guó)Starorious公司)；Tecan Infinite M1000 PRO酶標(biāo)儀(帝肯上海貿(mào)易有限公司)；L8900氨基酸自動(dòng)分析儀(日本日立公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 枸杞多糖的提取

參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行[1,4]。取枸杞干果500 g于-80 ℃冷凍后粉碎，以80%乙醇80 ℃除雜；藥渣揮干，料液比1∶10，80 ℃水提2次，每次1 h，水提液以10 000×g離心除雜，取上清液經(jīng)中空纖維膜(10 K)超濾濃縮，濃縮液冷凍干燥，即得枸杞總多糖(LBP，35 g)。

2.2 枸杞多糖分離和純化

采用MPLC對(duì)LBP進(jìn)行純化，配備Cond/pH/DAD檢測(cè)器和自動(dòng)收集系統(tǒng)。首先采用DEAE-650 M離子交換層析柱(25 × 200 mm；柱體積100 mL)進(jìn)行分離純化。在室溫下，分別考察pH7.0、8.0、9.0、9.5的40 mmol/L Tris-HCl緩沖液作為流動(dòng)相A，以0.5 mol/L NaCl和同一濃度緩沖液為流動(dòng)相B，流速5 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210和280 nm，考察色譜分離工藝參數(shù)和效果。

MPLC的常規(guī)分離流程：先用40 mmol/L pH9.0的Tris-HCl緩沖液平衡，再用0～0.5 mol/L NaCl 的Tris-HCl緩沖液線性梯度洗脫。用 Sephadex G25凝膠層析柱進(jìn)一步純化并脫鹽，所得組分超濾濃縮并凍干。

2.3 枸杞多糖結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 純度與分子量分布檢測(cè)

參考前期報(bào)道方法[12]，采用HPSEC法進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件：TSK G4000 PWXL色譜柱(7.8 × 300 mm)；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量20 μL。實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相對(duì)HPSEC法分析枸杞多糖的影響，包括0.5 mol/L硫酸銨、水、0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)。

采用T10、T40、T70、T110、T200、T500、T2000等系列分子量的葡聚糖(1.0 mg/mL)為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，以保留時(shí)間T 為橫坐標(biāo)，Mw 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。根據(jù)待測(cè)樣品的保留時(shí)間 T，通過回歸方程計(jì)算多糖樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。枸杞多糖供試品配制濃度1.0 mg/mL。

2.3.2 單糖組成分析

采用HPAEC-PAD分析樣品單糖組成[13]。色譜條件：Dionex CarboPac PA-1 色譜柱 (4.0 × 250 mm)，流動(dòng)相A為15 mmol/L NaOH溶液，流動(dòng)相B為15 mmol/L NaOH-15 mmol/L NaAc，流速為1 mL/min；梯度程序?yàn)?～10 min，0% B；10～40 min，0%～100% B；40～45 min，100% B；45～50 min，100%～0% B；50～60 min，0% B。根據(jù)單糖的保留時(shí)間確定樣品中存在的各單糖組成成分。

將多糖樣品溶液(10 mg/mL)與 1 mol/L三氟乙酸(TFA)各2 mL混合，置100 ℃烘箱中降解12 h，樣品減壓濃縮至干，配置成100 ppm的樣品溶液。另取巖藻糖等11種單糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，配置成濃度為25 ppm的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3.3 氨基酸組成測(cè)定

采用茚三酮柱后衍生化法檢測(cè)氨基酸含量[14]。色譜條件：色譜柱為日立磺酸型陽(yáng)離子樹脂填充柱(4.6 × 60 mm，3 μm)；緩沖液MCI Buffer L-8500-PH Kit；進(jìn)樣量1 500 μL；柱溫30 ℃；衍生液茚三酮顯色液；檢測(cè)波長(zhǎng)570和440 nm。

取樣品20 mg，加入10 mL，6 mol/L鹽酸溶液水解24 h，水解液蒸干，加入1 mL pH2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，配置成20 mg/mL的樣品溶液，另取18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，配置成濃度為25 ppm的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3.4 中性糖、半乳糖醛酸、蛋白質(zhì)總含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行[15]。半乳糖醛酸含量采用咔唑-硫酸法，以葡萄糖醛酸做標(biāo)曲，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)540 nm。中性糖含量測(cè)定采用硫酸-苯酚法，以葡萄糖做標(biāo)曲，并扣除半乳糖醛酸的干擾，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm。蛋白質(zhì)含量以蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)562 nm。

2.4 LBP的體外模擬消化道代謝分析

采用HPSEC法檢測(cè)LBP在人工胃腸環(huán)境中的代謝情況。為檢測(cè)可能的代謝產(chǎn)物，選用色譜柱為TSK G3000 PWXL(7.8 × 300 mm)，其余色譜條件同2.3.1項(xiàng)下。參照《中國(guó)藥典》2015年版四部規(guī)定配制人工胃液(pH5.0)及人工腸液(pH7.0)，分別在9.5 mL人工胃液、人工腸液中加入LBP(1.0 mg/mL)樣品溶液0.5 mL，置于37 ℃下培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間后取樣檢測(cè)。另選取正常SD大鼠的新鮮糞便，加3倍生理鹽水后勻漿，800×g離心5 min，取上層混懸液，即為腸道菌群液；在LBP(1.0 mg/mL)樣品溶液1.0 mL中，加入100 μL腸道菌群液，置于厭氧環(huán)境中37 ℃培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間；取樣加入甲醇1 mL，離心(12 000 ×g)，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置空白組，以生理鹽水代替LBP樣品溶液；設(shè)置LBP對(duì)照組，在室溫下放置相同時(shí)間。

3 結(jié)果與分析

3.1 枸杞多糖的提取與分離純化

枸杞多糖的分離純化方法參見2.2.2項(xiàng)下，代表性的樣品分離效果參見圖1。LBP經(jīng)一次色譜柱制備即可獲得P1～P4四個(gè)組分，且分離度滿足要求，重現(xiàn)性高。P1-P4四個(gè)組分經(jīng)超濾濃縮，Sephadex G25(25 × 200 mm；柱體積120 mL)脫鹽，凍干，獲得目標(biāo)組分LBP-1～4。LBP(6 g)經(jīng)多次純化，各自得LBP-1(16 mg)、LBP-2(18 mg)、LBP-3(30 mg)、LBP-4(38 mg)；經(jīng)HPSEC純度分析(圖2)，其中LBP-2、LBP-3為均一多糖，LBP-1、LBP-4還有少量雜峰、有待進(jìn)一步純化。

圖1 LBP的DEAE-650M中壓制備色譜圖Fig.1 Preparative MPLC of LBP using DEAE-650M column注：色譜峰P1～P4依次為L(zhǎng)BP-1～4。Note:Peak P1～P4 is LBP-1～4,respectively.

3.2 多糖純度與分子量測(cè)定

3.2.1 多糖的純度和分子量分析

經(jīng)方法學(xué)考察和優(yōu)化，采用適宜分子量范圍的TSK G4000色譜柱建立了LBP分子量測(cè)定的HPSEC法，其色譜條件參見2.3.1項(xiàng)下，色譜圖參見圖2。圖中顯示，LBP-2、LBP-3均為高純度的單一對(duì)稱峰，表明其為均一多糖。以系列葡聚糖對(duì)照品的平均重均分子量對(duì)數(shù)值 Mw對(duì)tR作線性回歸，得到回歸方程為y= -29 069x+ 486 207，R2= 0.997 3，表明該多糖在 10～200 kD的分子量范圍內(nèi)Mw對(duì)tR呈較好的線性關(guān)系。

表1 枸杞多糖組分LBP-1～4的相對(duì)分子量及保留時(shí)間

圖2 LBP及其組分樣品的 HPSEC色譜圖Fig.2 HPSEC chromatograms of LBPs

3.2.2 枸杞多糖單糖組成

采用HPAEC-PAD檢測(cè)，對(duì)枸杞多糖全水解樣品的單糖組成進(jìn)行定性分析。結(jié)果表明，枸杞多糖組分P1-P4均主要含有巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡糖糖、甘露糖等六種單糖，其中阿拉伯糖與半乳糖含量較高?？偠嗵荓BP也含有該6種多糖，其中阿拉伯糖、葡萄糖含量較高，并含有較高含量的半乳糖醛酸。

3.2.3 氨基酸組成的測(cè)定

樣品分析結(jié)果表明，LBP、LBP-1～4均含有組氨酸，胱氨酸，天門冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，谷氨酸，脯氨酸，羥脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，精氨酸等18種氨基酸，詳見表2。

表2 枸杞多糖中氨基酸的含量

3.2.4 中性糖、半乳糖醛酸、蛋白質(zhì)總含量的測(cè)定

枸杞多糖LBP,LBP-1～4各組分的中性糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)總含量見表3。由總計(jì)含量可見，各多糖組分純度均大于93%。其中，LBP-1～4各組分的總蛋白質(zhì)含量依此增高，而糖醛酸含量變化趨勢(shì)不一致，表明總蛋白質(zhì)(總的氨基酸組成)是影響DEAE色譜分離行為的主要因素。

表3 枸杞多糖的中性糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)總含量

3.2.5 LBP的體外模擬消化道代謝分析

在上述研究基礎(chǔ)上，采用HPSEC法對(duì)LBP在人工胃腸道的代謝情況進(jìn)行初步分析。研究結(jié)果表明，LBP在人工胃液中較為穩(wěn)定，無明顯代謝變化；在人工腸液中會(huì)發(fā)生降解代謝，在10 h時(shí)LBP基本代謝完全。在正常大鼠腸道菌群液的作用下，LBP在5 h即有M1(tR19 min)代謝產(chǎn)物峰出現(xiàn)；在10 h時(shí)，LBP有M1和M2(tR21 min)代謝產(chǎn)物峰出現(xiàn)，同時(shí)峰面積減少了38%，參見圖3所示。研究結(jié)果提示，枸杞多糖在人工腸液、腸道菌群中均可發(fā)生代謝，這可能是枸杞多糖作為益生元起效的主要途徑，其具體體內(nèi)代謝吸收規(guī)律有待進(jìn)一步研究。

圖3 LBP在體外腸道菌群中代謝(0～10 h)的 HPSEC色譜圖Fig.3 HPSEC chromatograms of LBP metabolized in intestinal flora (0～10 h) in vitro

4 結(jié)論

枸杞多糖作為枸杞子的主要功效物質(zhì)之一，相關(guān)的提取分離方法報(bào)道較多。傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)分離方法一般采用離子交換、分子排阻柱層析方法進(jìn)行，在收集流分后采用苯酚硫酸法進(jìn)行離線檢測(cè)，分離程序復(fù)雜、難以實(shí)現(xiàn)高效制備。本文首次采用中壓液相制備系統(tǒng)進(jìn)行分離，配備電導(dǎo)/pH/DAD多檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，從而易化了分離工藝參數(shù)的考察優(yōu)化，可以大幅提高分離方法開發(fā)效率。通過考察，選用DEAE-650M填料分離效果較好，可有效除去枸杞總多糖中的色素等大量雜質(zhì)；經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相條件、pH、離子強(qiáng)度、梯度洗脫條件、上樣量等工藝參數(shù)，結(jié)合后期超濾膜濃縮、Sephadex G25脫鹽、冷凍干燥等純化工序，通過一次性色譜分離程序即可實(shí)現(xiàn)4個(gè)多糖組分的有效分離(圖1)，建立的制備工藝可達(dá)到提高柱效、重現(xiàn)性好、容易放大制備規(guī)模的目的。采用本分離儀器和方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)克級(jí)以上LBP樣品進(jìn)行制備，可為枸杞多糖的放大純化工藝提供參考。

枸杞多糖作為一類糖蛋白，多糖的具體組分組成、結(jié)構(gòu)特征均具有復(fù)雜性，其分離純化方法、結(jié)構(gòu)表征和相關(guān)質(zhì)量分析的研究具有一定技術(shù)難度。中國(guó)藥典2015年版[1]僅收載了枸杞中總多糖(按葡萄糖計(jì))的含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。Tian[4]首次對(duì)寧夏枸杞中的多糖進(jìn)行了系統(tǒng)研究，分離獲得主要的5種不同分子量(23.7～214.8 kD)枸杞多糖，糖鏈上還連接有包括18種氨基酸的復(fù)雜多肽鏈修飾。Wu等[11]對(duì)中國(guó)50個(gè)主要枸杞樣品中多糖分子量進(jìn)行了測(cè)試，表明其大多由復(fù)雜的多種多糖組成。本文分析結(jié)果表明，LBP主要由4種分子量相近、單糖和氨基酸組成相似的組分LBP-1～4組成，主要區(qū)別在于蛋白含量不盡相同(表1-表2)。這與文獻(xiàn)報(bào)道的枸杞多糖組分結(jié)構(gòu)特征基本一致[3，4,15]，但具體分子量、單糖組成等結(jié)構(gòu)特征不完全相同。枸杞多糖中常含有大量雜質(zhì)、穩(wěn)定性較差，前處理、不同產(chǎn)地和藥用部位來源的原料、樣品貯存條件，這些因素都會(huì)影響到分離純化效果。

腸道菌群近年來被認(rèn)為是機(jī)體的代謝新器官，其對(duì)健康的影響受到關(guān)注，枸杞多糖作為益生元的功效已開始有文獻(xiàn)報(bào)道[8]。本文初步研究結(jié)果顯示，枸杞多糖在人工胃液中穩(wěn)定，在人工腸液、大鼠腸道菌群中可發(fā)生代謝。最近，Yu等[9]報(bào)枸杞多糖在人工胃腸道消化系統(tǒng)中沒有明顯降解；在人糞便菌群發(fā)酵24小時(shí)后發(fā)生水解，腸道微生物群可能通過消化其單糖、降低分子量、降低多糖總含量等途徑進(jìn)行代謝利用，這與本文研究結(jié)果基本一致。本文報(bào)道的LBP制備工藝、分子量和含量分析、腸道菌群代謝分析等研究方法和成果，可為枸杞多糖及其相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供參考。