李 建1，樊 華2，賀曉斌1，吳耀祿2，李曉勇3

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院 1.腺體血管外科，2.胃腸外科，3.肝膽外科，陜西 延安，716000)

早期篩查和科學(xué)的干預(yù)能夠降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率，傳統(tǒng)使用的篩查方法為糞隱血試驗、乙狀結(jié)腸癌和直接腸鏡檢查等，而腸鏡篩查由于自身侵入、取樣不便、特異性低等因素得不到廣泛的應(yīng)用[1-2]。因此尋求一種較為簡便、快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)的標(biāo)志物成為目前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)[3-6]。國外學(xué)者報道，結(jié)直腸癌患者組織中SFRP1和Septin9基因的啟動子區(qū)域CpC島的嘧啶發(fā)生甲基化，而在正常人體內(nèi)不會發(fā)生這種變化，因此可將這兩種基因甲基化作為診斷結(jié)直腸癌的一個特異性標(biāo)志物。本研究將本院近兩年收治的47例結(jié)直腸癌患者作為研究對象，分析SFRP1和Septin9甲基化篩查結(jié)直腸癌和癌前病變的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將我院自2016年6月至2018年6月間接受結(jié)直腸鏡檢查的患者80例作為研究對象，男性49例，女性31例，年齡35～83歲，平均年齡(61.75±7.13)歲；所有對象接受熒光定量PCR檢查外周血漿中SFRP1和Septin9基因甲基化的狀態(tài)，并使用膠體金免疫化學(xué)法進(jìn)行糞隱血檢測。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情并簽署同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)語言表達(dá)能力正常，能與調(diào)查人員進(jìn)行正常的溝通；(2)研究對象自愿參與本研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有其他腫瘤疾病史者；(2)已接受放射療法和化學(xué)療法；(3)既往腹部外科手術(shù)史；(4)妊娠期或哺乳期婦女；(5)排除腦卒中、老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的無法采集相關(guān)信息和精神分裂癥的患者；(6)患者或患者家屬不愿意參與研究，及未簽署知情同意書者。

1.3 血漿制備

采集10 mL外周靜脈血置于EDTA抗凝真空采血管中，1 350 g離心機(jī)(離心半徑為10 cm)離心12 min，吸取3.5 mL血漿進(jìn)行檢測，或者置于-20 ℃冰箱并在四周內(nèi)完成檢測。

1.4 SFRP1和Septin9基因甲基化檢測

選擇PCR熒光探針法試劑盒Epi proColon2.0 CE(Epigcnomics AG公司生產(chǎn))，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，共分為DNA提取、亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化、Bis-DNA結(jié)合、洗脫、PCR反應(yīng)、判定等幾個步驟，尤為注意的是每一個樣本連續(xù)進(jìn)行三次PCR反應(yīng)，2次或以上陽性判讀為陽性。

1.5 糞隱血篩查

使用膠體金免疫化學(xué)法對每一個對象進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，80例接受結(jié)腸鏡檢查和組織病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌的患者有47例(58.75%)，其中男性29例，女性18例，年齡36～83歲，平均年齡63.36±6.82歲；非結(jié)直腸癌的對照組33例(41.25%)，男性20例，女性13例，年齡35～81歲，平均年齡(59.86±6.72)歲，兩組患者性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.571，P>0.05)，年齡比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.458，P<0.05)。

結(jié)直腸癌組檢測SFRP1和Septin9基因甲基化陽性為34例，陽性率為72.34%，結(jié)直腸癌組患者SFRP1和Septin9基因甲基化檢測結(jié)果詳見表1。

2.2 SFRP1和Septin9基因和糞隱血篩查檢測對結(jié)直腸癌的診斷情況

甲基化SFRP1和Septin9基因甲基化診斷結(jié)直腸癌的敏感度為80.0%，特異度為95.3%，糞便免疫學(xué)檢測的敏感度為86.3%，特異度為54.3%，兩者結(jié)合后敏感度為97.6%，特異度為96.8%，明顯高于單獨(dú)檢測，詳見表2。

表1 結(jié)直腸癌組患者SFRP1和Septin9基因甲基化檢測結(jié)果

表2 SFRP1和Septin9基因和糞隱血篩查檢測對結(jié)直腸癌的診斷情況 (%)

3 討 論

SFRP1是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其表觀遺傳學(xué)修飾如甲基化與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。既往研究表明，SFRP1的甲基化會抑制SFRP1基因的表達(dá)，降低SFRP1蛋白水平，且這一現(xiàn)象與肺腺癌組織及結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。Septin9基因是在2008年首次報道的對結(jié)直腸癌篩查的特異性基因[6]。Septin9基因是septin基因家族的成員之一[7]，在除了植物細(xì)胞之外的真核生物中廣泛存在，其主要參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞計劃、囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞膜重構(gòu)等生物學(xué)過程，在這個過程中由于基因轉(zhuǎn)錄物質(zhì)所含翻譯起點(diǎn)和變異等不同，產(chǎn)生了很多個亞型[8-9]。對于Septin9基因來說，N末端的特點(diǎn)是擁有較長的脯氨酸區(qū)域，C端午卷曲結(jié)構(gòu)，研究該基因的生物學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，主要借助與中央?yún)^(qū)域的鳥核苷酸相互作用的序列，和肌動蛋白、微管蛋白等主要的細(xì)胞骨架成分之間相互作用，不斷銜接實現(xiàn)將其他蛋白募集至細(xì)胞質(zhì)的定位功能[10]。如果Septin9蛋白正常表達(dá)受到干擾后細(xì)胞就不能完全分裂，會產(chǎn)生雙核細(xì)胞；細(xì)胞基因不穩(wěn)定后容易向腫瘤轉(zhuǎn)化[11]。有資料顯示，血漿甲基化Septin9基因甲基化在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)明顯高于健康人群、也高于其他系統(tǒng)惡性腫瘤和非惡性病變患者，而且在使用亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA進(jìn)行10倍稀釋后進(jìn)行檢測方式改進(jìn)后，能夠明顯的提高結(jié)直腸癌的檢測率和特異度[12-13]。

本研究中使用的檢測試劑盒是在PCR試驗方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了幾項改進(jìn)，如減少洗脫液的量提高提取DNA的濃度，去除PCR抑制物、增加引物濃度、降低內(nèi)參照的濃度、使用不同熒光探針等，從而提高檢測的敏感度和特異性[9]。由研究結(jié)果可以看出，檢測SFRP1和Septin9基因甲基化聯(lián)合糞隱血免疫膠體金進(jìn)行檢查具有一定的互補(bǔ)性，能夠提高檢測的敏感度和特異度。本研究的不足之處是沒有對進(jìn)展期的結(jié)直腸癌患者SFRP1和Septin9基因甲基化程度進(jìn)行觀察，而且樣本數(shù)量偏少；再者結(jié)直腸癌患者屬于高危人群，驗前概率偏高，具有轉(zhuǎn)診偏倚，這個結(jié)果是否符合一般風(fēng)險人群，需要進(jìn)一步深入研究進(jìn)行驗證。而且在臨床實際檢查過程中，使用結(jié)直腸鏡檢查的費(fèi)用偏低，使用試劑盒檢查費(fèi)用昂貴，對于經(jīng)濟(jì)條件較差的患者來說需要承擔(dān)的經(jīng)濟(jì)壓力比較大[14-15]。

綜上所述，SFRP1和Septin9基因甲基化聯(lián)合糞免疫學(xué)檢查可提高結(jié)直腸癌和癌前病變診斷的敏感度和特異度，而且具有無創(chuàng)、采樣簡單、依從性強(qiáng)、實驗方法穩(wěn)定等特點(diǎn)，適宜于臨床推廣使用。