李軍營 晉艷 王俊 蘇國興

摘要：為明確鉀營養(yǎng)供應(yīng)對煙堿生物合成的影響規(guī)律，采用定量PCR和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，研究不同供鉀量條件下，煙草葉片煙堿含量和根系腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）與喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（QPT）的表達(dá)情況。結(jié)果表明，低鉀供應(yīng)會增加煙葉的煙堿含量、促進(jìn)根系PMT基因的表達(dá);高鉀供應(yīng)對煙葉的煙堿合成和根系的PMT基因表達(dá)具有明顯的抑制效應(yīng)。低鉀處理后再恢復(fù)正常鉀供應(yīng)水平，可顯著降低由低鉀供應(yīng)對煙堿合成和PMT基因表達(dá)的促進(jìn)作用。不同的供鉀水平同樣影響QPT基因的表達(dá)水平，但與煙堿積累量的變化不存在明顯的相關(guān)性。因此，煙草植株的煙堿含量受供鉀水平的影響，鉀可能通過控制根系腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)來影響煙葉中煙堿的積累。

關(guān)鍵詞：煙草;鉀營養(yǎng);腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶;喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶;煙堿;生物合成;關(guān)鍵基因相對表達(dá)量

中圖分類號：S572.06 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0106-03

收稿日期：2018-05-07

基金項目：中國煙草總公司云南省公司資助項目（編號：2017YN06、2016YN05、2016YN28）。

作者簡介：李軍營（1978—），男，河北滄州人，博士，副研究員，主要從事煙草栽培研究。Tel：（0871）65106249;

通信作者：晉 艷，碩士，研究員，主要從事煙草栽培研究。Tel：（0871）65100188;

煙葉中的鉀離子參與煙葉的生理生化反應(yīng)，與煙株的抗逆性關(guān)系密切，對于煙草農(nóng)業(yè)來說，它還影響著煙葉的內(nèi)在品質(zhì)和工業(yè)可用性，通常把鉀含量作為衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)[1]。鉀對煙葉成熟度、香吃味、燃燒性、安全性等方面均有重要影響，鉀含量越高，往往煙葉的質(zhì)量越優(yōu)[2]。在鉀對煙堿積累的影響方面，不同學(xué)者的觀點不一致。左天覺認(rèn)為，鉀對煙堿的積累幾乎沒有影響[3];胡國松等報道，高鉀施用量增加了上部葉中的煙堿含量[4];舒海燕等研究了施鉀對煙草農(nóng)藝性狀和煙堿含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施鉀可提高煙葉中鉀含量，促進(jìn)植株生長，降低煙葉中煙堿含量[5]。然而關(guān)于鉀對煙堿合成的影響機制尚不清楚。Richards等研究表明，鉀營養(yǎng)與植物腐胺的積累有關(guān)，缺鉀可促進(jìn)多種植物腐胺的積累[6-7]。由于腐胺是煙堿生物合成的前體物質(zhì)，鉀有可能通過腐胺影響煙葉煙堿的積累。為驗證這個假設(shè)，本研究采用砂培法，以不同濃度的鉀溶液處理煙草，并采用定量PCR技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，分析不同供鉀量對煙草煙堿含量和煙堿代謝關(guān)鍵酶腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）、喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（QPT）基因相對表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗用煙草（Nicotiana tabacum L.）品種為K326，由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。試驗于2015年在蘇州大學(xué)的陽光房內(nèi)進(jìn)行，采用砂基培養(yǎng)法培育煙苗，蛭石和石英砂體積比為1 ∶1。煙草培育采用漂浮育苗法，培育至4葉期后，選取生長整齊的幼苗移入砂培塑料盆中。培育期間，晝溫平均為26.5 ℃，夜溫平均為18.3 ℃。在幼苗生長至8葉1心時，對煙株進(jìn)行如下處理：（1）對照（CK）的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營養(yǎng)液（K+含量為0.23 mol/L）;（2）T1處理的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營養(yǎng)液中鉀元素（K）稀釋10倍;（3）T2處理的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營養(yǎng)液中K稀釋50倍;（4）T3處理的培養(yǎng)液為1/2 Hoagland營養(yǎng)液中的K擴大5倍;（5）T4處理為恢復(fù)組，即T2處理10 d后，再在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中恢復(fù) 10 d。由于Hoagland營養(yǎng)液中的K由KNO3提供，T1、T2處理因稀釋導(dǎo)致的氮素?fù)p失用NaNO3補足，調(diào)節(jié)pH值至5.8±0.1，每隔2 d換1次營養(yǎng)液。每盆栽植2株煙草，各處理均設(shè)6組重復(fù)。隨機選擇長勢均勻一致，沒有發(fā)生病蟲害的煙株，CK、T1、T2、T3分別在處理前及處理后10、20 d采集整株煙苗，T4在處理后直接取樣，其中葉片用于煙堿含量測定，根系用于PMT基因和QPT基因的表達(dá)分析。

1.2 營養(yǎng)指標(biāo)測定

將新鮮煙株用蒸餾水洗凈，并用吸水紙吸干表面水分，分別稱地上與地下部分質(zhì)量，低溫（-70 ℃）保存。

1.3 PMT和QPT定量PCR分析

取煙草根組織，在液氮中迅速研磨，采用Trizol-氯仿-異丙醇法[8]提取總RNA，并采用分光光度計與瓊脂糖凝膠電泳對提取的總RNA進(jìn)行檢測。用DNase I在37 ℃下處理RNA提取樣品20 min，以消除DNA干擾。將處理后的總RNA在65 ℃下變性5 min，向總體積為15 mL的總RNA反應(yīng)混合液中加入1 mL隨機引物（50 mmol/L）、4 mL 10 mmol/L dNTP，反應(yīng)體系中二者濃度分別為2.5、2.0 mmol/L，迅速冰浴冷卻。以提取獲得的總RNA，合成cDNA的第1條鏈。向反應(yīng)體系中加入4 mL 5×UltraScript RTase Buffer和1 mL UltraScript RTase Mix（含200 U/mL RTase，20 U/mL RNasin）后，在 30 ℃ 下預(yù)熱10 min，52 ℃下孵育60 min，隨后在70 ℃下滅活15 min，以降解逆轉(zhuǎn)錄酶。

用Primer Express software設(shè)計PCR引物，以煙草α-微管蛋白基因（GenBank登錄號為J421411.1）為內(nèi)參，該內(nèi)參基因的引物為α-tublin-F：5′-GGAACCTTACAACAGTGTCCT-3′，α-tublin-R：5′-CAAACCTCAACGAGCAGCAAC-3′;PMT基因（GenBank登錄號為D28506.1）的定量PCR引物為tPMT-F：5′-ACAGAGAATGGTGGATTTCC-3′，tPMT-R：5′-CGATTGAAGGATAACGAAGC-3′;QPT基因（GenBank登錄號為AB038494.1）的定量PCR引物為tQPT-F：5′-CAGCAATAGCCACCAAGAATAC-3′，tQPT-R：5′-TGTCGCCTTACAAGTCACATC-3′。

上述所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所用熒光染料為Thermo SBYR GREEN qPCR Master Mix（ROX included）。用兩步法PCR擴增程序進(jìn)行PCR擴增：50 ℃ 尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）預(yù)處理2 min，95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸60 s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法[9]進(jìn)行分析。

1.4 煙堿含量的測定

取煙草中部新鮮葉樣，105 ℃殺青后，70～80 ℃烘干，過60目篩，取0.3 g（精確至0.000 1 g）試樣，根據(jù)YC/T 383—2010[10]，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，測定煙堿含量，所用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀型號為7890B/5977A GCMS（美國Agilent公司），煙堿標(biāo)準(zhǔn)品購自SIGMA公司。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 21.0軟件經(jīng)one-way ANOVA分析后，進(jìn)行Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供鉀水平對煙株營養(yǎng)生長的影響

從圖1可以看出，含不同濃度鉀離子的營養(yǎng)液對煙草營養(yǎng)生長的影響存在顯著差異。與對照相比，煙草地上部分與地下部分鮮質(zhì)量均隨鉀供應(yīng)水平的降低而減少。與對照相比，低鉀水平T1處理和T2處理煙草的地上部分、地下部分鮮質(zhì)量分別減少30.40%、37.64%和42.93%、57.03%，且對照與T1、T2處理間的差異達(dá)到顯著水平。高鉀水平T3處理煙草地上部分與地下部分的營養(yǎng)生長也顯著低于對照。

由圖2可知，隨著鉀離子濃度的恢復(fù)，地上部分和根系的營養(yǎng)生長可部分恢復(fù)。

2.2 不同供鉀水平對煙草葉片煙堿積累的影響

由圖3可知，在對照生長條件下，煙草葉片的煙堿含量隨著植株的生長顯著增加，與0 d相比，生長10、20 d后，煙堿含量分別增加24.17%、61.91%。

不同供鉀水平對煙草葉片煙堿積累的影響如圖4所示，隨著鉀離子濃度的降低，煙堿的積累量顯著增加，處理后 10 d，T1、T2處理分別比對照顯著增加3.60%、10.50%;而高鉀水平T3處理對煙堿的積累則具有顯著的抑制作用。對T2處理10 d后煙草進(jìn)行鉀恢復(fù)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鉀離子濃度的恢復(fù)，煙草葉片的煙堿含量隨之減少，較恢復(fù)前降低 13.30%。不同供鉀水平下煙草的煙堿積累量與溶液中的鉀離子濃度呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，即低鉀水平會促使煙株大量積累煙堿，而高鉀處理會抑制煙株體內(nèi)煙堿的合成。

2.3 不同供鉀水平對PMT、QPT基因表達(dá)的影響

2.3.1 不同供鉀水平對PMT基因表達(dá)的影響

由圖5可知，在生長前期，煙草植株有較高的PMT基因表達(dá)水平，且隨著煙株的生長，表達(dá)量逐漸增強，不同測定時間之間的差異達(dá)顯著水平。

由圖6可知，處理后10 d，不同鉀離子供應(yīng)水平的營養(yǎng)液對煙草PMT基因的表達(dá)影響顯著，隨著鉀離子濃度的降低，PMT基因表達(dá)水平顯著升高，T1、T2處理分別比對照增加12.89%、18.93%，;相反，T3處理的PMT基因表達(dá)被顯著抑制。對T2處理10 d后煙草進(jìn)行鉀恢復(fù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鉀離子濃度的恢復(fù)，煙草根系中的PMT基因表達(dá)量顯著下降，較恢復(fù)前下降37.37%。不同供鉀水平下煙草根系中的PMT基因表達(dá)水平與脅迫溶液中的鉀離子濃度呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，即低鉀水平會促進(jìn)煙草根系PMT基因表達(dá)量的增加，而高鉀處理會抑制PMT基因在煙草根系中的表達(dá)。

2.3.2 不同供鉀水平對QPT基因表達(dá)的影響

由圖7可知，在生長前期，煙草根系中的QPT基因表達(dá)量較高，隨著煙株的生長，QPT表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢，表現(xiàn)出明顯的表達(dá)時間特異性。圖8為不同供鉀水平對煙草根系喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響。與PMT基因不同，QPT基因的表達(dá)水平較低，且隨著供鉀水平的降低呈先升高后下降趨勢，而5倍高鉀處理與低鉀處理相比對QPT基因表達(dá)量有一定程度的上調(diào)作用，但差異不顯著。連續(xù)低鉀（T2處理）脅迫20 d，根系中QPT基因的表達(dá)量達(dá)到最低值;對T2處理10 d后煙草進(jìn)行鉀恢復(fù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，QPT基因表達(dá)量能基本恢復(fù)。

3 討論

煙堿在煙草根中合成后，經(jīng)木質(zhì)部運輸?shù)饺~片，貯存在液泡中[11-13]。由于煙葉煙堿含量約占其生物堿總量的90%，煙堿含量的高低影響著煙草的品質(zhì)[14]。本研究結(jié)果表明，鉀離子供應(yīng)水平與煙葉煙堿的積累量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提高鉀離子濃度能有效降低煙草煙堿的積累量。同時還發(fā)現(xiàn)，鉀離子供應(yīng)水平與煙草根系中的PMT基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即低鉀會促進(jìn)PMT基因的表達(dá)，使煙草大量積累煙堿，而較高的鉀離子濃度，則會使PMT基因表達(dá)量下降，?進(jìn)而降低煙堿

的積累量。研究后期QPT基因表達(dá)水平較低，說明鉀可能不通過調(diào)控QPT基因的表達(dá)來調(diào)控?zé)焿A類物質(zhì)積累。鉀供應(yīng)水平與煙堿積累和PMT基因表達(dá)的這種調(diào)節(jié)關(guān)系，被低鉀處理后的恢復(fù)試驗結(jié)果進(jìn)一步驗證，隨著供鉀水平的恢復(fù)，PMT基因表達(dá)量下降，煙堿積累量隨之減少。鉀營養(yǎng)與植物的腐胺代謝有關(guān)[6-7]，而腐胺是煙堿生物合成關(guān)鍵酶PMT的作用底物，其可在底物水平上影響酶的活性，進(jìn)而影響煙堿的積累。本研究結(jié)果表明，鉀可能通過影響PMT基因的表達(dá)來影響煙堿的積累。至于鉀調(diào)節(jié)PMT基因表達(dá)的機制尚需深入研究。

有關(guān)鉀營養(yǎng)對煙堿積累的影響已有大量的報道，基本結(jié)論是土壤的供鉀水平與煙株生長和煙葉煙堿含量關(guān)系密切，但對于供鉀水平與煙堿含量確切關(guān)系的結(jié)論尚不統(tǒng)一[3-5]。

本研究結(jié)果顯示，與對照相比，隨著營養(yǎng)液中鉀離子濃度的降低，煙株地上與地下部分的鮮質(zhì)量隨之降低，煙堿含量略有升高;鉀離子濃度為對照組的5倍時，營養(yǎng)生長亦呈現(xiàn)下降趨勢，煙堿含量略有下降，這可能是因為營養(yǎng)液中鉀離子濃度過大時，會影響植株對其他離子的吸收，進(jìn)而影響煙株的營養(yǎng)生長和煙堿的合成[15]?？梢姡外浰娇纱龠M(jìn)煙葉中煙堿的合成，而高鉀水平的作用則相反。

本研究發(fā)現(xiàn)，鉀離子可能通過影響PMT基因的表達(dá)來影響煙草中煙堿的積累，前人鮮有報道。在生產(chǎn)實踐中，本研究可為低鉀土壤通過增施鉀肥來調(diào)控?zé)焿A含量和提高煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]閆慧峰，石 屹，李乃會，等. 煙草鉀素營養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2013，15（1）：123-129.

[2]中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所. 中國煙草栽培學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005：321-323.

[3]左天覺. 煙草的生產(chǎn)、生理和生物化學(xué)[M]. 朱尊權(quán)，譯.上海：上海遠(yuǎn)東出版社，1993：306-352.

[4]胡國松，王志彬，王 凌，等. 烤煙煙堿累積特點及部分營養(yǎng)元素對煙堿含量的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（1）：10-14.

[5]舒海燕，楊鐵釗，曹剛強，等. 煙葉鉀含量與煙株農(nóng)藝性狀和煙堿含量的相關(guān)分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（2）：275-278.

[6]Richards F J，Coleman R G. Occurrence of putrescine in potassium deficient barley[J]. Nature，1952，170（4324）：460.

[7]Watson M B，Malmberg R L. Regulation of Arabidopsis thaliana（L.）heynh arginine decarboxylase by Potassium deficiency stress[J]. Plant Physiology，1996，111（4）：1077-1083.

[8]丁福章，李繼新，袁有波，等. 煙草不同組織總RNA的提取方法初探[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（12）：98-101.

[9]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[10]國家煙草專賣局. 煙草及煙草制品 煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明和假木賊堿的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法：YC/T 383—2010[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[11]Dawson R F. Accumulation of nicotine in reciprocal grafts of tomato and tobacco[J]. American Journal of Botany，1942，29（1）：66-71.

[12]Tso T C，Jeffrey R N. Studies on tobacco alkaloids：II.The formation of nicotine and nornicotine in tobacco supplied with 15N[J]. Plant Physiology，1957，32（2）：86-92.

[13]Saunders J A. Investigations of vacuoles isolated from tobacco：I. Quantitation of nicotine[J]. Plant Physiology，1979，64（1）：74-78.

[14]Saitoh F，Noma M，Kawashima N. The alkaloid contents of 60 nicotiana species[J]. Phytochemistry，1985，24（3）：477-480.

[15]張一揚，肖漢乾，李明德，等. 鉀素營養(yǎng)對烤煙生長及養(yǎng)分吸收的影響[J]. 土壤通報，2004，35（4）：466-469.