溫曉靜，鐘磊，鐘宏文

(1.贛州市贛縣區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 贛州341100；2.贛州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 贛州 341000)

2型糖尿病 (T2DM)有更明顯的遺傳基礎(chǔ)，發(fā)病多見于成年人而非青少年、發(fā)病機(jī)制主要為胰島素抵抗、胰島素分泌缺陷和非胰島β細(xì)胞自身免疫破壞。雖2型糖尿病具有遺傳異質(zhì)性，但大多數(shù)伴2型糖尿病和空腹高血糖的患者特征性表現(xiàn)為胰島素抵抗、胰島素分泌障礙和肝臟葡萄糖產(chǎn)生增加等[1-4]。miRNA作為天然的基因調(diào)控因子在腫瘤發(fā)生、血管生成、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等許多重要的病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4-5]。大量研究表明異常表達(dá)的miRNA與許多疾病的發(fā)生發(fā)展存在潛在的聯(lián)系，miRNA有可能運(yùn)用于疾病的早期診斷及治療靶點(diǎn)[6-7]。miRNA-375是胰島組織特異表達(dá)的miRNA，能影響胰島β細(xì)胞的胰島生物合成素的分泌過程[8]。本研究選取初診的2型糖尿病患者和健康對(duì)照者外周抗凝全血，檢測(cè)miRNA-375的表達(dá)情況，并在體外培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)一步探討其表達(dá)調(diào)控機(jī)制，期盼為揭示2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2015年1月-2016年12月在我院內(nèi)科確診為T2DM的患者為研究對(duì)象。收集全血標(biāo)本共計(jì)20例。其中男性12例，女性8例；年齡38～76歲，平均52.4歲；對(duì)照組為20例健康體檢者。標(biāo)本收集均通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 Ficoll分離液購(gòu)自廣州藍(lán)吉生物技術(shù)有限公司，miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司、RIPA細(xì)胞裂解液北京塞默飛生物科技有限公司 、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司、實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) HT29細(xì)胞株購(gòu)自廣州藍(lán)吉生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)體系：DMEM/F12培養(yǎng)液含10%新生牛血清，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、臺(tái)盼藍(lán)拒染率＞95%的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 生物信息分析 運(yùn)用生物學(xué)信息軟件targetscan7.0預(yù)測(cè)miR-375調(diào)控的靶基因。

1.5 RT-PCR檢測(cè) 采取TRizol試劑提取 RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，作為 PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系：cDNA 5.0 μl，上游引物0.5μl， 下游引物 0.5μl，2x SYBR Green qPCR SuperMix 15μl，dH2O 4.0 μl， 總體積 25 μl。 反應(yīng)條件 ：55℃ 2min；94℃ 2min； 94℃ 15s，56℃ 32s 讀板，35 cycles；融解曲線分析：溫度 56℃，94℃，每個(gè)樣重復(fù)3次。PRKD1引物序列：上游引物(5’AATGCAGCTTTCATGTATCCACCA3’)，下 游 引 物(5’-GCATTCCAGCTCTCGCAAATCTA-3’)；U6 上 游 引物(5’-CTCGCTTCGGCAGCACA3’)，下游引物(5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)。 GAPDH 上游引物(5’CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’),下游引 物 (5’TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCAC-3’)；miR-375上游引物 (5’-AATGCAGCTTTCATGTATCCACCA-3’)， 下游引物 (5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’)。以 U6,GAPDH 為內(nèi)參照，以 2-ΔΔCt法表示相對(duì)定量結(jié)果。

1.6 Western blot檢測(cè) 以 1.0×106/孔的密度將人HT29細(xì)胞接種12孔培養(yǎng)板，總體積1mL，細(xì)胞分為空白對(duì)照組和miR-375組，培養(yǎng)48 h，消化收集各組細(xì)胞。加入RIPA緩沖液，維持4℃。加入PMSF，冰上孵育 30min，移入離心管 4℃，15min。上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存。進(jìn)行Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液，并加等體積的2×電泳加樣緩沖液，沸水浴中3min，上樣電泳(濃縮膠 20mA，分離膠 35mA)。再在電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(100mA40min)。膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色。加入電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)試劑，顯影。 BI-2000 型圖像分析軟件分析積分光密度，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.7 雙熒光報(bào)告基因載體的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)分組：空白組(control,單加細(xì)胞)，hsa-miR-375 組(hsa-miR-375模擬物，20μmol/L),hsa-miR-375抑制劑組(inhibitor組,20μmol/L)；陰性對(duì)照組(NC，negative control,20μmol/L)，NC inhibitor組(negative control inhibitor，20μmol/L)。

以人外周血單個(gè)核細(xì)胞的DNA為模板擴(kuò)增PRKD1 的 3’UTR 序列，并引入 XhoI、Not I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。PCR產(chǎn)物膠回收后克隆到psiCHECK-2質(zhì)粒海腎熒光素酶基因的下游，重組載體命名為 psiCHECK-2-PRKD1-3’UTR。 對(duì)psiCHECK-2-PRKD1-3’UTR重組質(zhì)粒 “種子區(qū)”的堿基進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變后的質(zhì)粒為psiCHECK-2-PRKD1-3’UTR-Mut。 將 HT29 細(xì)胞消化接種至48孔板,分別轉(zhuǎn)染miRNA模擬物以及陰性對(duì)照，雙熒光素酶活性檢測(cè)嚴(yán)格按照Promega提供的產(chǎn)品說明書操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析 (one-way ANOVA)分析組間差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)水平 miR-375在2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)，而PRKD1呈低表達(dá)，兩者的相對(duì)表達(dá)量具有負(fù)相關(guān)性運(yùn)用生物學(xué)信息軟件targetscan7.0軟件預(yù)測(cè)到PRKD1是miR-375調(diào)控的靶基因之一。進(jìn)一步運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)2型糖尿病患者及正常健康外周血單個(gè)核細(xì)胞中 miR-375和PRKD1的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果顯示：miR-375在2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)，而PRKD1呈低表達(dá)，兩者的相對(duì)表達(dá)量具有負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R為-0.992，P＜0.05。 結(jié)果提示 miR-375與 PRKD1在2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)可能存在負(fù)性調(diào)控關(guān)系。見圖1。

圖1 Figure1 RT-PCR檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)水平

2.2 miR-375靶向調(diào)控PRKD1的表達(dá) psiCHECK-2-PRKD1-WT-3’UTR 與 miR-375mimics共轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞，導(dǎo)致熒光活性減弱，說明PRKD1-WT-3’UTR與miR-375發(fā)生結(jié)合作用。psiCHECK-2-PRKD1-mut-3’UTR 與 miR-375mimics共 轉(zhuǎn) 染HT29細(xì)胞，熒光活性未發(fā)生改變，說明不存在結(jié)合作用 (Fig 2)。結(jié)果表明：miR-375靶向調(diào)控PRKD1的表達(dá)。見圖2。

2.3 miR-375抑制PRKD1的表達(dá)與翻譯 miR-375抑制劑組PRKD1基因與蛋白的相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。結(jié)果表明miR-375抑制PRKD1的表達(dá)與翻譯。見圖3。

3 討論

圖2 Figure 2 miR-375靶向調(diào)控PRKD1的表達(dá)

圖3 Figure 3 miR-375抑制PRKD1的表達(dá)與翻譯

糖尿病的發(fā)病因素主要包括遺傳和生理的改變，主要分為1型和2型糖尿病[9]。但是，目前對(duì)于糖尿病的發(fā)病分子機(jī)制的研究尚未完全闡明。miRNAs是葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)器，這種新型的非編碼RNA通過與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)并結(jié)合，實(shí)施在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制[10-11]。miRNAs在各種細(xì)胞中的的表達(dá)呈現(xiàn)特異性和時(shí)間依賴性，這決定了miRNAs在眾多生物過程的特定環(huán)節(jié)對(duì)靶基因的表達(dá)具有重要調(diào)控作用[12]。

在胰腺和胰島β細(xì)胞中表達(dá)的眾多miRNAs中，miR-375參與調(diào)控葡萄糖引起的胰島素分泌過程[7]。PRKD1是一種新發(fā)現(xiàn)的鈣離子／鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，有3個(gè)家族成員，其PRKD1廣泛表達(dá)于各組織和器官中，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，在調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞生物學(xué)行為、維持細(xì)胞功能方面發(fā)揮十分重要的作用[13]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)miR-375在2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)，PRKD1呈低表達(dá)。進(jìn)一步構(gòu)建雙熒光報(bào)告基因載體證實(shí)了PRKD1是miR-375調(diào)控的靶基因之一，miR-375具有抑制PRKD1的表達(dá)與翻譯的功能。已有研究顯示：miR-375通過NF-KB信號(hào)通路調(diào)控Mtpn的表達(dá)和胰島素分泌，NF-KB激活與葡萄糖激發(fā)的胰島素分泌相關(guān)[14-15]。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-375在2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中高表達(dá)，對(duì)PRKD1具有負(fù)向調(diào)控作用，這為揭示2型糖尿病的發(fā)病分子機(jī)制提供了線索。