李青，袁有華

(河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州450003)

雙路普雷沃菌是普雷沃菌屬中的重要菌群之一，屬于人體的正常菌群，在機(jī)體缺氧，免疫力低下或長(zhǎng)期服用免疫抑制劑類藥物時(shí)可引起人體感染，其可在全身各個(gè)部位定值，在合適環(huán)境下大量繁殖造成組織器官損傷[1]。雙路普雷沃菌是一種專性厭氧菌，由于厭氧菌培養(yǎng)條件特殊，在臨床工作中檢出率比較低。我科近日從一例陰囊膿腫患者的穿刺膿液標(biāo)本及一例剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的血液培養(yǎng)中檢出了雙路普雷沃菌，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 病例資料

患者1，男性，41歲，以“發(fā)現(xiàn)陰囊腫塊30年余，陰囊腫脹、疼痛5d”為主訴入院，入院查體：體溫36.6℃，脈搏80次/min，呼吸20次/min，神志清，精神可，雙側(cè)睪丸發(fā)育正常，陰囊發(fā)育正常，體積增大，5天前不明誘因致陰囊腫脹伴疼痛，陰莖根部可觸及波動(dòng)性包塊，無尿頻、尿急、肉眼血尿，無發(fā)熱、咳嗽、咳痰、惡心、嘔吐等不適癥狀。否認(rèn)高血壓、心臟病史，否認(rèn)糖尿病史、腦血管病史，有結(jié)核病史，否認(rèn)外傷、輸血史。輔助檢查：血常規(guī)WBC9.77×109/L，尿常規(guī)、凝血六項(xiàng)及傳染病檢查未見異常。彩超示陰囊皮下混合回聲包塊，在超聲下進(jìn)行陰囊膿腫穿刺抽液術(shù)，抽出血性粘稠膿液10ml。

患者2，女性，25歲，以“停經(jīng) 8月余，下腹部墜脹3d”為主訴入院，入院查體：體溫36.8℃，脈搏96 次/min，呼吸 20 次/min，血壓 123/82mmHg，心肺聽診無異常，雙下肢無浮腫，腹部膨隆如孕周，宮高34cm，腹圍112cm，無壓痛、反跳痛，胎心率138次/分，未觸及宮縮，無陰道流液、無出血，彩超示晚孕單胎，胎盤前置(中央型)，臍帶繞頸。入院診斷：宮內(nèi)孕36+2周，孕3產(chǎn)1，兇險(xiǎn)性前置胎盤，瘢痕子宮。入院第二天行子宮下段第二次剖宮產(chǎn)術(shù)，術(shù)后第二天體溫升高，最高達(dá)39.2℃。于左上肢靜脈、右上肢靜脈、左下肢靜脈各采集20ml血量，分別注入需氧和厭氧培養(yǎng)瓶。

2 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定

2.1 培養(yǎng)結(jié)果 患者1的膿液標(biāo)本革蘭染色后油鏡下見大量成簇分布的革蘭陰性球桿菌見圖1，然后接種于血平板、麥康凱平板和巧克力平板，常規(guī)培養(yǎng)至48h后仍未見細(xì)菌生長(zhǎng)?？紤]有厭氧菌可能，將病人標(biāo)本重新接種于血平板、麥康凱平板和巧克力平板，放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋后溫箱培養(yǎng)至48h，血平板上發(fā)現(xiàn)灰白色、圓形、濕潤(rùn)、光滑的中等菌落，邊緣整齊見圖2，涂片染色為革蘭陰性球桿菌見圖3，巧克力平板上發(fā)現(xiàn)灰白色、圓形、針尖樣菌落見圖4，麥康凱平板未見細(xì)菌生長(zhǎng)。

圖1 直接涂片下革蘭染色鏡檢結(jié)果(×1000)

圖2 厭氧培養(yǎng)48h血平板菌落形態(tài)

圖3 純培養(yǎng)革蘭陰性球桿菌染色結(jié)果(×1000)

圖4 厭氧培養(yǎng)48h巧克力平板菌落形態(tài)

將患者2的3套血培養(yǎng)瓶放入BACTEC FX全自動(dòng)血培養(yǎng)儀中培養(yǎng)，3個(gè)厭氧瓶在33h內(nèi)均報(bào)陽(yáng)性，3個(gè)需氧瓶5d均未報(bào)陽(yáng)性。陽(yáng)性厭氧瓶革蘭染色后均見大量革蘭陰性球桿菌見圖5，使用質(zhì)譜快速鑒定為雙路普雷沃菌。選取左上肢靜脈的厭氧瓶轉(zhuǎn)種于血平板、麥康凱平板和巧克力平板各2個(gè)，其中一套平板放溫箱培養(yǎng)至48h后，未見細(xì)菌生長(zhǎng)。另一套平板放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋培養(yǎng)至48h后，血平板上發(fā)現(xiàn)灰白色、圓形、濕潤(rùn)、光滑的中等菌落，邊緣整齊，涂片染色后鏡檢為革蘭陰性球桿菌，巧克力平板上發(fā)現(xiàn)灰白色、圓形、針尖樣菌落，形態(tài)同患者1，麥康凱平板未見細(xì)菌生長(zhǎng)。

圖5 陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶涂片革蘭染色鏡檢結(jié)果(×1000)

2.2 鑒定結(jié)果 挑取血平板上單個(gè)菌落使用MALDI-TOF(德國(guó)布魯克公司全自動(dòng)質(zhì)譜儀)快速鑒定細(xì)菌，結(jié)果為雙路普雷沃菌，患者1的分值是2.000見圖6，患者2的分值是2.193。使用16Sr-RNA測(cè)序通用引物16S-F(5’-AGGAGGTGATCCAACCGCA－3’)和 16S-R(5’-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT－3’)對(duì)兩患者待測(cè)菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[2]，擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析，為雙路普雷沃菌，符合率99%，部分測(cè)序見圖7。

2.3 臨床治療療效 患者1陰囊膿腫穿刺抽液術(shù)中抽取出10ml血性膿液，術(shù)后使用左氧氟沙星靜脈滴注，疼痛癥狀迅速緩解?；颊?剖宮產(chǎn)術(shù)后頭孢呋辛靜脈點(diǎn)滴預(yù)防感染，術(shù)后第二天高熱，給予哌拉西林鈉他唑巴坦鈉聯(lián)合左氧氟沙星氯化鈉注射液進(jìn)行治療，連續(xù)使用3天，產(chǎn)婦體溫36.5℃，恢復(fù)正常。

3 討論

本文患者1的陰囊膿腫常見病原菌有金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等需氧菌[3，4]?；颊?涂片中發(fā)現(xiàn)革蘭陰性球桿菌，但常規(guī)培養(yǎng)未見細(xì)菌生長(zhǎng)，結(jié)合標(biāo)本異常性狀考慮可能是厭氧菌感染，所以重新接種放厭氧袋中培養(yǎng)，48h后培養(yǎng)鑒定出雙路普雷沃菌。

本文患者2術(shù)后出現(xiàn)高熱后及時(shí)采集3套血培養(yǎng)，3套血培養(yǎng)的厭氧瓶均檢出雙路普雷沃菌，故可以排除污染菌，使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀快速鑒定細(xì)菌，將血培養(yǎng)陽(yáng)性的Ⅱ級(jí)報(bào)告時(shí)間提前了48h，彌補(bǔ)了血培養(yǎng)鑒定時(shí)間長(zhǎng)的缺陷，為臨床快速診斷提供了幫助。

縱觀近年來檢出的厭氧菌，我們不難發(fā)現(xiàn)多數(shù)厭氧菌感染為無芽孢的革蘭陰性桿菌，種類較多，其中以類桿菌屬中的脆弱類桿菌多見[5，6]，像本文中的雙路普雷沃菌也有報(bào)道，但以本文中患者2的血流感染為多見[7]。在實(shí)驗(yàn)室檢查中應(yīng)注重細(xì)菌涂片結(jié)果，如果涂片中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，培養(yǎng)未見細(xì)菌生長(zhǎng)應(yīng)考慮有厭氧菌可能，需重新接種標(biāo)本做厭氧培養(yǎng)。如果遇到膿液標(biāo)本的顏色性狀明顯異常，則可以常規(guī)培養(yǎng)的同時(shí)加做厭氧培養(yǎng)，提高厭氧菌的檢出率，早日發(fā)現(xiàn)病原菌。

雙路普雷沃菌屬于普雷沃菌屬，普雷沃菌屬是一種從類桿菌屬中分出的新菌屬，專性厭氧，目前有50多個(gè)種，多為條件致病菌，主要存在于口腔、腸道、女性生殖道等處，在合適的環(huán)境中大量繁殖引起組織器官的損傷，如牙周炎、陰唇癤腫、盆腔膿腫等[8-11]。

圖6 MALDI-TOF鑒定質(zhì)譜蛋白圖譜

圖7 16SrRNA基因序列測(cè)序圖

隨著最近幾年對(duì)厭氧菌的關(guān)注，現(xiàn)在已經(jīng)了解的是大部分的腦膿腫、牙周膿腫、盆腔膿腫等是由厭氧菌感染引起的[12-13]，但臨床實(shí)驗(yàn)室中厭氧菌的陽(yáng)性檢出率明顯低，與各實(shí)驗(yàn)室條件、標(biāo)本送檢過程不規(guī)范、臨床早期使用抗生素等均有關(guān)系。在臨床工作中應(yīng)加強(qiáng)與臨床的溝通，嚴(yán)格按照操作規(guī)程，規(guī)范標(biāo)本的采集及運(yùn)送過程。實(shí)驗(yàn)室檢查人員應(yīng)綜合標(biāo)本特點(diǎn)、感染部位、臨床癥狀以及抗生素治療效果等推測(cè)是否有厭氧菌感染特征，若存在厭氧菌感染可能應(yīng)及時(shí)加做厭氧培養(yǎng)，提高病原菌的檢出率，為臨床治療提供依據(jù)。