王曉，馬慧，張衛(wèi)衛(wèi)

(洛陽(yáng)市中心醫(yī)院肝膽一區(qū)，河南 洛陽(yáng) 471001)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PHC)的發(fā)生率具有顯著的上升趨勢(shì)，流行病學(xué)研究證實(shí)，PHC的年平均發(fā)病率可達(dá)283～459/10萬(wàn)人左右[1]。臨床上PHC的發(fā)生能夠?qū)е禄颊呖傮w生存時(shí)間的下降，影響患者的5年生存率等預(yù)后指標(biāo)[2]。

在探討PHC發(fā)病機(jī)制的過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)微小RNA水平的改變，能夠通過(guò)影響肝臟上皮細(xì)胞的生物學(xué)特征，進(jìn)而參與到早期PHC的發(fā)生過(guò)程中。微小RNA-355(mir-355)是微小RNA家族的重要成員，mir-355的表達(dá)濃度的維持能夠有效穩(wěn)定癌細(xì)胞的增殖速度，抑制癌細(xì)胞對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和侵襲過(guò)程[3]。同時(shí)mir-355的表達(dá)，還能夠提高癌細(xì)胞的分化成熟能力，降低癌細(xì)胞的低分化或者中低分化的風(fēng)險(xiǎn)[4]。部分研究者探討了mir-355在胃癌或者結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)情況，認(rèn)為mir-355的表達(dá)下降能夠顯著促進(jìn)胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生[5]。為了深入揭示mir-355的表達(dá)與PHC的關(guān)系，從而為臨床上PHC患者的診療提供理論基礎(chǔ)，本次研究取我院2015年1月至2016年12月經(jīng)病理學(xué)明確診斷的90例PHC患者，探討了mir-355的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院2015年1月至2016年12月經(jīng)病理學(xué)明確診斷的90例PHC患者(PHC組)、慢性乙肝后肝硬化患者90例(對(duì)照組(、90例健康體檢志愿者(健康組)。PHC組，年齡44～79歲，平均為60.5±11.5歲，男52例、女38例，其中腫瘤單發(fā)66例、多發(fā)24例，病灶直徑＞5cm 49例、≤5cm 41例，分化程度：高分化22例、中分化38例、低分化30例；TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期35例、Ⅲ期30例、Ⅳ期5例。對(duì)照組，年齡39～76歲，平均為58.0±10.5歲，男49例、女41例。健康組，年齡 41～79歲，平均為 57.5±13.2歲，男 47例、女 43例。三組研究對(duì)象的年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)PHC患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范2015年版》、慢性乙肝或慢性乙肝后肝硬化患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考 《內(nèi)科學(xué)》人民衛(wèi)生出版社中的標(biāo)準(zhǔn)；(2)PHC的確診以病理學(xué)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)；(3)本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)重度營(yíng)養(yǎng)不良；(2)具有放化療病史；(3)精神疾病患者；(4)免疫疾??；(5)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病。

1.2 指標(biāo)檢測(cè)方法 mir-355的檢測(cè)：采集患者空腹血5ml，加入0.2ml的氯仿，2℃～8℃ 冰凍離心機(jī)中離心(12000g/min，15min)，反復(fù)一次洗滌 RNA，棄上清，在管底部可見一乳白色小沉淀物，加入 1 ml75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其終濃度均為 20pmol/ul，制備反應(yīng)體系，RT-PCR擴(kuò)增的條件與參數(shù)：48℃，45min，94℃，2min； 94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2 min共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)完畢后68℃延伸7min。

2 結(jié)果

2.1 三組研究對(duì)象血清mir-355水平比較 PHC組、對(duì)照組的血清中mir-355水平顯著低于健康組(P＜0.05)，PHC組的血清中mir-355水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)；見表 1，圖 1。

表1 三組研究對(duì)象血清mir-355水平比較()

表1 三組研究對(duì)象血清mir-355水平比較()

組別 n mir-355（2-△△ct） F 值 P 值PHC組對(duì)照組健康組90 90 90 1.14±0.40 1.69±0.50 2.26±0.59 27.594 0.000

圖1 血清mir-355水平擴(kuò)增電泳圖

2.2 不同病理學(xué)特征的PHC患者血清mir-355水平比較 病灶多發(fā)、病灶直徑≥5cm、發(fā)生脈管侵犯、低分化、TNM分期(Ⅲ期+Ⅳ期)的PHC患者血清mir-355水平低于病灶單發(fā)、病灶直徑＜5cm、未發(fā)生脈管侵犯、高中分化、TNM分期(Ⅰ期+Ⅱ期(的PHC患者(P＜0.05)；不同AFP水平PHC患者的血清mir-355水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；見表2。

表2 不同病理學(xué)特征的PHC患者血清mir-355水平比較()

表2 不同病理學(xué)特征的PHC患者血清mir-355水平比較()

因素 n mir-355(2-△△ct) t值 P值A(chǔ)FP(μg/L)≥20＜20病灶數(shù)目單發(fā)多發(fā)病灶直徑(cm)≥5＜5脈管侵犯是 否分化程度高+中低分化TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期Ⅲ期+Ⅳ期62 28 66 24 49 41 38 52 60 30 55 35 1.10±0.34 1.24±0.37 1.26±0.38 0.81±0.26 0.91±0.39 1.35±0.33 0.83±0.27 1.31±0.38 1.20±0.38 1.01±0.35 1.33±0.35 0.86±0.37-1.759 5.354-5.712-6.651 2.294 6.074 0.082 0.000 0.000 0.000 0.024 0.000

3 討論

PHC的病情進(jìn)展相對(duì)較為隱匿，雖然早期可表現(xiàn)為惡心嘔吐等臨床癥狀，但疾病總體的早期診斷水平較低[6]。同時(shí)PHC的手術(shù)治療或者放化療治療后，患者的病死率或者生存時(shí)間等指標(biāo)均無(wú)明顯改善[7,8]。一項(xiàng)包含了334例樣本量的多中心PHC臨床研究顯示，PHC的早期診斷水平不足55%，治療后的病情緩解率不足40%，無(wú)瘤生存時(shí)間不足48個(gè)月[9]。本次研究通過(guò)對(duì)于相關(guān)分子生物學(xué)水平的相關(guān)研究，不僅能夠?yàn)榻沂綪HC的發(fā)病機(jī)制提供參考，同時(shí)可以對(duì)于疾病的診斷提供潛在的臨床指標(biāo)。

微小RNA在惡性腫瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，其能夠參與到腫瘤細(xì)胞的代謝、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中。mir-355水平的改變對(duì)于腫瘤信號(hào)通路的抑制，能夠減少癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的激活，降低癌細(xì)胞DNA的擴(kuò)增速度。mir-355能夠促進(jìn)癌細(xì)胞膜表面糖蛋白配體的沉默，降低細(xì)胞周期調(diào)控依賴性蛋白激活的轉(zhuǎn)錄水平，穩(wěn)定G1/S期比例，降低G1期細(xì)胞的總數(shù)[10]。近年來(lái)相關(guān)基礎(chǔ)方面的研究顯示，mir-355其表達(dá)濃度的改變能夠通過(guò)穩(wěn)定上皮細(xì)胞的極性，抑制癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而降低了癌細(xì)胞的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)[11]。部分研究者以及探討了mir-355的表達(dá)與直腸癌或者結(jié)腸癌的關(guān)系，認(rèn)為mir-355的表達(dá)缺失是導(dǎo)致惡性腫瘤放化療治療敏感性下降的重要因素[12]。雖然有部分研究者探討了mir-355在PHC患者中的表達(dá)情況，但相關(guān)研究?jī)H限于流行病學(xué)研究的探討，未深入探討mir-355的表達(dá)與PHC患者臨床病理特征和甲胎蛋白(AFP)的關(guān)系。

對(duì)于mir-355的表達(dá)分析研究發(fā)現(xiàn)，mir-355在肝癌或者肝硬化患者中的表達(dá)濃度均明顯的下降，低于正常對(duì)照組人群，差異較為明顯，特別是在PHC組患者中，mir-355的表達(dá)下降更為明顯，提示了mir-355的表達(dá)下降能夠影響PHC的發(fā)生過(guò)程。通過(guò)匯集不同的相關(guān)文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為這主要考慮與mir-355的下列幾個(gè)方面的作用有關(guān)[13]：(1)mir-355的表達(dá)下降能夠?qū)е赂闻K癌細(xì)胞變形能力的上升，癌細(xì)胞對(duì)于臨近正常肝臟小葉組織的浸潤(rùn)能力明顯的增強(qiáng)；(2)mir-355的表達(dá)下降導(dǎo)致癌細(xì)胞周期調(diào)控的異常，癌細(xì)胞快速跨越G0期的能力明顯增加。余斌等[14]研究者也發(fā)現(xiàn)，在PHC患者中，mir-355的表達(dá)濃度可平均下降35%以上，特別是在合并有明顯的高腫瘤負(fù)荷表現(xiàn)或者遠(yuǎn)期病死率較高的患者中，mir-355的表達(dá)濃度的下降更為明顯。對(duì)于mir-355的表達(dá)與PHC患者臨床病理特征的分析研究可見，發(fā)生了脈管浸潤(rùn)、癌細(xì)胞分化程度較差或者臨床分期較晚的患者中，mir-355的表達(dá)濃度可顯著的下降，提示了mir-355的表達(dá)與PHC患者的臨床病理特征具有密切關(guān)系，這主要由于mir-355的表達(dá)下降能夠影響到癌細(xì)胞的分化成熟過(guò)程，導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)于腹腔內(nèi)臨近臟器組織損傷風(fēng)險(xiǎn)的增加；在腫瘤直徑較大或者多發(fā)性的腫瘤患者中，mir-355的表達(dá)濃度明顯的下降，mir-355與PHC患者一般性臨床資料特征的關(guān)系，考慮與mir-355的表達(dá)缺失能夠影響到癌細(xì)胞的增殖過(guò)程，從而促進(jìn)腫瘤體積的增大[15]。AFP是PHC相對(duì)特異性的腫瘤指標(biāo)，AFP的上升對(duì)于PHC的診斷和治療預(yù)后的評(píng)估均具有重要的意義，本次研究并未發(fā)現(xiàn)AFP的表達(dá)水平與mir-355的關(guān)系，提示mir-355的表達(dá)缺失并不能影響到癌細(xì)胞對(duì)于AFP的釋放，但部分研究者認(rèn)為在AFP較高的患者中，mir-355的表達(dá)濃度可進(jìn)一步的下降，本次研究并未相關(guān)結(jié)論，考慮可能與PHC患者的基礎(chǔ)性病情差別較大或者AFP的檢測(cè)時(shí)機(jī)的不同有關(guān)。